En teknik til isolering af portal fibroblaster fra rottelever er beskrevet. Lever er perfunderet og fordøjes<em> In situ</em> Med collagenase, efterfulgt af<em> Ex vivo</em> Fordøjelse af leveren opslæmningen og størrelsen selektion af celler. Denne fremgangsmåde tilvejebringer en ren population af portal fibroblaster uden behov for passage i kultur.
Leverfibrose er defineret ved overdreven aflejring af ekstracellulær matrix af aktiverede myofibroblaster. Der er flere forløbere for hepatiske myofibroblaster, herunder hepatiske stjerneformige celler, portal fibroblaster og knoglemarv afledt fibroblaster 1. Hepatiske stjerneformige celler har været det bedste undersøgt, men portalen fibroblaster anerkendes i stigende grad som vigtige bidragsydere til myofibroblast pool, især i biliær fibrose 2. Portal fibroblaster gennemgå spredning i respons på galde epitel skade, potentielt spille en central rolle i de tidlige stadier af galde ardannelse 3-5. En metode til at isolere portal fibroblaster ville tillade in vitro-undersøgelse af dette cellepopulation og føre til større forståelse af den rolle portalen fibroblaster spille i biliær fibrose.
Portal fibroblaster er blevet isoleret under anvendelse af forskellige teknikker, herunder udvækst 6, 7 og Liver perfusion med enzymatisk fordøjelse efterfulgt af størrelsesbestemmelse selektion 8. Fordelen ved fordøjelse og størrelsesselektion teknik i forhold til udvæksten teknik er, at celler kan studeres uden nødvendigheden af passage i kultur. Her beskriver vi en modificeret version af det oprindelige teknikken beskrevet af Kruglov og Dranoff 8 til isolering af portal fibroblaster fra rottelever som resulterer i en relativt ren population af primære celler.
Portal fibroblaster spiller en vigtig rolle i galde fibrose. Her beskriver vi en modifikation af den oprindelige protokol offentliggjort af Kruglov og Dranoff 8 til isolering portal fibroblaster fra rottelever, hvilket giver en enkel måde at undersøge denne cellepopulation in vitro.
Denne fremgangsmåde anvender protease-fordøjelse og størrelse baseret filtrering. Den primære fordel ved fremgangsmåden er, at en relativt ren population af celler kan opnås uden passage i kultur, således at undersøgelsen af genekspression eller funktionelle celle adfærd flere dage efter isolering. Denne teknik giver også mulighed for at isolere celler fra både raske og syge lever.
Et af de mest kritiske trin i denne protokol, er den enzymatiske nedbrydning af den hepatiske parenchym. For at sikre vellykket fordøjelse, er det vigtigt at bekræfte, at blod er fuldstændig drænet ud af leveren under den indledende perfuonen ved at sørge for, at der overhovedet er blegning af leveren. For at lette dette, er det muligt at bruge en vatpind til forsigtigt at massere leveren, mens perfusion. Over-fordøjelse af leverparenkym resulterer i et lavt udbytte af levedygtige celler, mens under-fordøjelse vil gøre det vanskeligt at adskille leverparenkym fra det biliære træ. Idet præparater med pronase har variationer i enzymatisk aktivitet mellem forskellige partier, optimering af den anvendte mængde kan være nødvendig, når der er lavt udbytte af levedygtige celler.
Denne protokol kan modificeres til isolering af portal fibroblaster fra muselever eller unge rottelever ved anvendelse af en mindre sporvidde IV kateter til kanyle portvenen, nedsætte mængden af perfusionsopløsninger i forhold til dyrets vægt og faldende leveren perfusionshastigheden til omkring 10 ml / min.
Portal fibroblaster i kultur undergår myofibroblastic differentiering i 10-14 dage, som det fremgår af α-SMA exdepression 9. Forskellige markører er blevet anvendt til at skelne portal fibroblaster fra hepatiske stjerneformige celler, herunder fibulin-2, IL-6, elastin, nucleosidtriphosphat diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1 og neuronale proteiner såsom synaptophysin 2, 6, 10, 11 . Vi har fundet, at elastin er en god markør for portal fibroblaster, selv efter myofibroblastic differentiering, mens NTPDase2 tabt efter portal fibroblaster har undergået kultur efter flere dage 9. Derfor har vi typisk bekræfter isolering af portal fibroblaster ved hjælp af immunfluorescens-farvning for elastin.
Begrænsning ved denne teknik er, at umiddelbart efter portal fibroblast isolation, der er en lille brøkdel af kontaminerende celler, herunder Kupffer-celler og biliære celler. Portal fibroblaster vil vokse disse kontaminerende celler inden for 2-3 dage, men giver en relativt ren population (> 98%) 9.
SiIOU portal fibroblaster i kultur gennemgå myofibroblastic differentiering på vævsdyrkningsplast, vi typisk studere disse celler senest 7 dage efter isolation. Cellerne holdes i portal fibroblast dyrkningsmedier indeholdende 10% føtalt bovint serum, som beskrevet i metodeafsnittet. Imidlertid vil disse celler overlever i vækstmedier indeholdende 2% føtalt bovint serum i flere dage. Vi typisk bruger ikke lave serum-medier, før mindst 24 timer efter isolation. Når portal fibroblaster undergår myofibroblastic differentiering, kan de passager flere gange og opbevares som frosne lagre af myofibroblaster.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af NIH R01 DK05823 (til RGW), F32 DK083213 (til JWW), F30 DK081265 (til ALO), og ved et tilskud fra Fred og Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (til RGW).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |