En teknik för att isolera portalen fibroblaster från råttlever beskrivs. Levrarna perfunderas och digereras<em> In situ</em> Med kollagenas, följt av<em> Ex vivo</em> Nedbrytning av levern slammet och storleken val av celler. Denna metod ger en ren population av portal fibroblaster utan behov av passage genom odlingen.
Leverfibros definieras av överdriven avsättning av extracellulär matris genom aktiverade myofibroblaster. Det finns flera föregångare till hepatiska myofibroblaster, inklusive celler hepatiska stellatceller, portal fibroblaster och benmärg som härrör fibroblaster 1. Hepatiska stellatceller celler har varit den bäst studerade, men portal fibroblaster allt erkänns som viktiga bidragsgivare till myofibroblast poolen, särskilt i galla fibros 2. Portal fibroblaster genomgår proliferation som svar på gallan epitelial skada, eventuellt spela en viktig roll i de tidiga stadierna av gallan ärrbildning 3-5. En metod för att isolera portal fibroblaster skulle släppa in vitro studie av denna cell population och leda till större förståelse av den roll portalen fibroblaster spela i gallan fibros.
Portal fibroblaster har isolerats med användning av olika tekniker innefattande utväxt 6, 7 och liver perfusion med enzymatisk nedbrytning följt av storleken val 8. Fördelen med att uppslutningen och storleksselektion teknik jämfört med utväxt teknik är att celler kan studeras utan nödvändigheten av passage genom odlingen. Här beskriver vi en modifierad version av den ursprungliga tekniken beskriven av Kruglov och Dranoff 8 för isolering av portal fibroblaster från råttlever som resulterar i en relativt ren population av primära celler.
Portal fibroblaster spela en viktig roll i gallan fibros. Här beskriver vi en modifiering av den ursprungliga protokollet publicerats av Kruglov och Dranoff 8 för att isolera portalen fibroblaster från råttlever, vilket ger ett enkelt sätt att studera denna cell population in vitro.
Detta tillvägagångssätt använder proteasdigestion och storlek-baserade filtrering. Den primära fördelen med förfarandet är att en relativt ren population av celler kan erhållas utan passage i kultur, vilket möjliggör studier av genuttryck eller funktionella cellbeteende flera dagar efter isolering. Denna teknik erbjuder också möjligheter för att isolera celler från både friska och sjuka lever.
En av de mest kritiska stegen i detta protokoll är enzymatisk spjälkning av den hepatiska parenkym. För att säkerställa framgångsrik digerering, är det viktigt att bekräfta att blod helt töms ut från levern under den initiala perfunen genom att se till att det ens blekning av levern. För att underlätta detta är det möjligt att använda en bomullspinne för att försiktigt massera levern, medan perfusion. Över-digerering av resultaten leverparenkym i ett lågt utbyte av viabla celler, medan under-digerering kommer att göra det svårt att separera leverparenkym från gallträdet. Eftersom beredningar av pronas har variabilitet i enzymatisk aktivitet mellan olika partier, optimering av den använda mängden kan behövas när det är lågt utbyte av levande celler.
Detta protokoll kan modifieras för att isolera portal fibroblaster från muslever eller ung råttlever genom användning av en mindre gauge intravenös kateter att kanylera portvenen, minskar volymen hos perfusionslösningar i förhållande till djurets vikt och minskning av hastigheten leverperfusion till ca 10 ml / min.
Portal fibroblaster i kultur genomgå myofibroblastic differentiering i 10-14 dagar, vilket framgår av α-SMA expression 9. Olika markörer har använts för att särskilja portalen fibroblaster från celler hepatiska stellatceller, inklusive Fibulin-2, IL-6, elastin, nukleosidtrifosfat diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), kofilin-1 och neuronala proteiner såsom synaptofysin 2, 6, 10, 11 . Vi har funnit att elastin är en bra markör för portal fibroblaster, även efter myofibroblastic differentiering, medan NTPDase2 går förlorad efter portal fibroblaster har genomgått kultur efter flera dagar 9. Därför bekräftar vi vanligtvis isolering av portalen fibroblaster genom immunofluorescens-färgning för elastin.
Begränsning av denna teknik är att, omedelbart efter portalen fibroblast isolering, det finns en liten fraktion av kontaminerande celler inkluderande Kupffer-celler och gallceller. Portal fibroblaster växer ur dessa kontaminerande celler inom 2-3 dagar, men i utbyte ge en relativt ren population (> 98%) 9.
SiNCE portal fibroblaster i kultur genomgår myofibroblastic differentiering på vävnadsodlingsplast, studerar vi vanligtvis dessa celler inom 7 dagar efter isolering. Cellerna hålls i portal medium fibroblastkultur innehållande 10% fetalt bovint serum, såsom beskrivs i metoddelen. Emellertid kommer dessa celler att överleva i odlingsmediet innehållande 2% fetalt bovint serum under flera dagar. Vi normalt inte använder låga serum media förrän tidigast 24 timmar efter isolering. När portal fibroblaster genomgår myofibroblastic differentiering, kan de passager flera gånger och hålls som frysta lager av myofibroblaster.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av NIH R01 DK05823 (till RGW), F32 DK083213 (till JWW), F30 DK081265 (till ALO), och genom ett bidrag från Fred och Suzanne Biesecker Pediatric Lever Center (till RGW).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |