一个从大鼠肝门成纤维细胞的分离技术。肝脏被灌注和消化<em>原位</em>胶原酶,其次是<em>体外</em>消化肝细胞浆和大小选择。这种方法提供了一个门户网站的成纤维细胞的纯人口,而不需要通过文化。
肝纤维化是指由活化的肌成纤维细胞外基质过度沉积。有多种肝肌纤维母细胞的前体,包括肝星状细胞,门成纤维细胞和骨髓成纤维细胞1。肝星状细胞已经最好的研究,但门户网站成纤维细胞的肌纤维母细胞池的重要因素,特别是在2胆管纤维化,人们日益认识到。胆管上皮损伤门户成纤维细胞进行增殖,可能发挥在胆道疤痕3-5的早期阶段的关键作用。门户的成纤维细胞的分离方法,将允许在这个细胞群的体外研究,并导致更大的门户成纤维细胞在胆道纤维化中发挥的作用的认识。
门户网站成纤维细胞已被隔离,使用各种技术,包括生长6,7和李VER灌流酶消化大小选择8。相比生长技术的消化和大小选择技术的优点是,可以不通过文化的必要性研究细胞。在这里,我们描述了原有技术分离大鼠肝门成纤维细胞,导致在一个相对纯净的原代细胞的人口由克鲁格洛夫和Dranoff 8所述的修改后的版本。
门户网站的成纤维细胞发挥胆道纤维化的重要作用。在这里,我们描述了一个隔离大鼠肝门成纤维细胞,提供了一个简单的方法来研究这种细胞在体外人口克鲁格洛夫和Dranoff 8发表的原始协议的修改。
这种方法使用蛋白酶消化和规模为基础的过滤。该方法的主要优点是没有获得人口相对纯的细胞,可以通过在文化,使基因表达的研究或几天后隔离功能细胞的行为。这种技术还提供了隔离健康和患病的肝脏细胞的潜力。
在该协议中最关键的步骤之一是肝实质的酶消化。为了确保成功消化,重要的是确认在初始灌注肝脏血液已完全耗尽,锡安作出肯定,甚至有肝热烫。为了促进这一点,可以用棉签轻轻按摩肝脏,而灌注。消化肝实质结果在一个活细胞的产量低,而在消化将使其难以分开胆管树的肝实质。由于蛋白酶的筹备工作有可能需要在不同的地段,优化使用量之间的酶活性的变异时,有活菌产量低。
该协议可能会被修改为门户的成纤维细胞从小鼠肝或年轻大鼠肝脏隔离使用一个较小的计静脉导管,cannulate门静脉灌注液量,减少动物体重的比例,并减少肝脏灌注率约10毫升/分钟。
门户成纤维细胞培养,经过10-14天的肌纤维母细胞的分化,由α-SMA的前pression 9。肝星状细胞,包括fibulin-2,IL-6,弹性,以区别于门户网站的成纤维细胞已被用于各种标记核苷三磷酸diphosphohydrolase-2(NTPDase2),cofilin的-1和神经突触2,6,10,11,如蛋白质。我们发现弹性是一个门户网站的成纤维细胞的标记,甚至肌纤维母细胞分化后,,而NTPDase2丢失门户成纤维细胞后,经历了9几天后,文化。因此,我们通常确认为弹性蛋白免疫荧光染色门成纤维细胞的分离。
这项技术的限制后,立即门户成纤维细胞的分离,是有污染的细胞,包括Kupffer细胞和胆管细胞的一小部分。门户长大成纤维细胞会在2-3天内这些污染的细胞,然而,产生一个相对纯净的人口(98%)9。
硅,NCE文化门户的成纤维细胞进行组织培养塑料肌纤维母细胞分化,我们通常在7天的隔离研究这些细胞。细胞维持在含10%胎牛血清的媒体门户的成纤维细胞培养,在方法部分所述。然而,这些细胞就会生存含2%胎牛血清几天媒体的增长。我们通常不使用低血清培养基,直到隔离后至少24小时。一旦门户成纤维细胞进行肌纤维母细胞的分化,他们可以传代数次和保持肌纤维母细胞冷冻库存。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由国立卫生研究院以R01 DK05823(RGW),F32 DK083213(JWW),F30 DK081265(阿拉伯劳工组织),拨款和弗雷德“苏珊娜比泽克小儿肝病中心(RGW)从。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |