Une technique pour isoler les fibroblastes portail de foie de rat est décrit. Foies sont perfusés et digéré<em> In situ</em> Avec de la collagénase, suivie par<em> Ex vivo</emLa digestion> de la suspension du foie et de sélection de taille de cellules. Ce procédé fournit une population pure de fibroblastes portail sans qu'il soit nécessaire pour le passage de la culture.
La fibrose du foie est défini par le dépôt excessif de matrice extracellulaire par les myofibroblastes activés. Il ya plusieurs précurseurs de myofibroblastes hépatiques, y compris les cellules étoilées du foie, des fibroblastes portail et la moelle osseuse des fibroblastes issus 1. Cellules étoilées hépatiques ont été la mieux étudiée, mais les fibroblastes du portail sont de plus en plus reconnue en tant que contributeurs importants à la piscine myofibroblastes, en particulier dans la fibrose biliaire 2. Fibroblastes portail subissent une prolifération en réponse à des lésions épithéliales biliaires, ce qui pourrait jouer un rôle clé dans les premiers stades de la cicatrisation biliaire 3-5. Une méthode d'isolement des fibroblastes portail permettrait étude in vitro de cette population cellulaire et conduire à une meilleure compréhension du rôle des fibroblastes portail jouer dans la fibrose biliaire.
Fibroblastes portail ont été isolés en utilisant diverses techniques, y compris l'excroissance 6, 7 et liperfusion ver avec digestion enzymatique suivie par la sélection de 8 taille. L'avantage de la digestion et de la technique de sélection de taille par rapport à la technique de l'excroissance est que les cellules peuvent être étudiés sans la nécessité de passage dans la culture. Ici, nous présentons une version modifiée de la technique originale décrite par Kruglov et Dranoff 8 pour l'isolement des fibroblastes portail de foie de rat qui se traduit par une population relativement pure de cellules primaires.
Fibroblastes portail jouer un rôle important dans la fibrose biliaire. Ici, nous décrivons une modification du protocole original publié par Kruglov et Dranoff 8 pour isoler les fibroblastes portail de foie de rat, en fournissant un moyen simple d'étudier cette population de cellules in vitro.
Cette approche utilise la digestion de protéase et basée sur la taille de filtration. Le principal avantage de cette méthode est que la population est relativement pure de cellules peuvent être obtenues sans passage dans la culture, permettant l'étude de l'expression des gènes ou le comportement des cellules fonctionnelles plusieurs jours après l'isolement. Cette technique offre également la possibilité d'isoler des cellules de foie à la fois sains et malades.
Une des étapes les plus critiques de ce protocole est la digestion enzymatique du parenchyme hépatique. Pour assurer une digestion réussie, il est important de confirmer que le sang est complètement évacuée du foie au cours de la première perfusion en faisant en sorte qu'il n'y est même blanchir du foie. Pour faciliter cela, il est possible d'utiliser un coton-tige pour masser doucement le foie tout en perfusant. Au cours de digestion des résultats du parenchyme hépatique dans un faible rendement de cellules viables, tandis que la sous-digestion, il sera difficile de séparer le parenchyme hépatique à partir de l'arbre biliaire. Comme les préparatifs de la pronase ont variabilité de l'activité enzymatique entre les différents lots, l'optimisation de la quantité utilisée peut être nécessaire quand il ya un faible rendement de cellules viables.
Ce protocole peut être modifié pour isoler les fibroblastes portail de foie de souris ou de foie de rat jeune en utilisant un gabarit plus petit cathéter IV à cathétériser la veine porte, la diminution du volume des solutions de perfusion en proportion de poids de l'animal, et en diminuant le débit de perfusion du foie à environ 10 ml / min.
Fibroblastes portail de la culture subissent une différenciation myofibroblastique en 10-14 jours, comme en témoignent les α-SMA excompression 9. Divers marqueurs ont été utilisés pour distinguer les fibroblastes portail à partir de cellules étoilées du foie, y compris fibuline-2, IL-6, l'élastine, nucléoside triphosphate diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofiline-1 et des protéines neuronales telles que la synaptophysine 2, 6, 10, 11 . Nous avons constaté que l'élastine est un bon marqueur pour les fibroblastes portail, même après la différenciation myofibroblastique, tandis que NTPDase2 est perdu après fibroblastes portail ont subi la culture, après plusieurs jours 9. Par conséquent, nous avons généralement de confirmer l'isolement des fibroblastes portail par immunofluorescence de l'élastine.
La limitation de cette technique est que, immédiatement après l'isolement des fibroblastes portail, il ya une petite fraction de contaminer les cellules, y compris les cellules de Kupffer et les cellules biliaires. Fibroblastes portail va dépasser ces cellules contaminantes dans les 2-3 jours, cependant, ce qui donne une population relativement pur (> 98%) 9.
Since fibroblastes portail de la culture subissent une différenciation myofibroblastique sur le plastique de culture tissulaire, nous avons généralement l'étude de ces cellules dans les 7 jours d'isolement. Les cellules sont maintenues dans le portail des milieux de culture de fibroblastes contenant 10% de sérum de veau fœtal, comme décrit dans la section des méthodes. Cependant, ces cellules vont survivre dans des milieux de croissance contenant 2% de sérum de veau fœtal pendant plusieurs jours. En général, nous n'utilisons pas de faibles milieux sans sérum pendant au moins 24 heures après l'isolement. Une fois les fibroblastes portail subissent une différenciation myofibroblastique, ils peuvent être repiquées à plusieurs reprises et conservées comme des stocks congelés de myofibroblastes.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par le NIH R01 DK05823 (à RGW), F32 DK083213 (à JWW), F30 DK081265 (à ALO), et par une subvention de la Fred et Suzanne Biesecker Centre hépatique pédiatrique (à PBE).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |