Una tecnica per isolare fibroblasti portale dal fegato di ratto è descritto. I fegati sono perfusi e digerito<em> In situ</em> Con collagenasi, seguita da<em> Ex vivo</emDigestione> dell'impasto fegato e selezione dimensioni delle cellule. Questo metodo fornisce una popolazione pura di fibroblasti portale senza la necessità di passaggio in coltura.
Fibrosi epatica è definita dalla eccessiva deposizione di matrice extracellulare da miofibroblasti attivati. Ci sono precursori multipli di miofibroblasti epatici, tra cui le cellule stellate epatiche, fibroblasti del portale e del midollo osseo fibroblasti derivati 1. Cellule stellate epatiche sono stati i più studiati, ma fibroblasti portali sono sempre più riconosciute come fattori importanti per la piscina miofibroblasti, in particolare nella fibrosi biliare 2. Portale subiscono la proliferazione dei fibroblasti in risposta alla lesione epiteliale biliare, potenzialmente giocare un ruolo chiave nelle fasi iniziali della biliare cicatrici 3-5. Un metodo per isolare fibroblasti portale consentirebbe studio in vitro di questa popolazione di cellule e portare ad una maggiore comprensione del ruolo fibroblasti portale svolgere nella fibrosi biliare.
Fibroblasti portale sono stati isolati utilizzando varie tecniche tra cui escrescenza 6, 7 e liperfusione ver con la digestione enzimatica seguita dalla selezione del formato 8. Il vantaggio della digestione e selezione tecnica dimensioni rispetto alla tecnica escrescenza è che le cellule possono essere studiate senza la necessità di passaggio in coltura. Qui, si descrive una versione modificata della tecnica originale descritta da Kruglov e Dranoff 8 per l'isolamento di fibroblasti portale da fegato di ratto che si traduce in una popolazione relativamente pura di cellule primarie.
Portale fibroblasti svolgono un ruolo importante nella fibrosi biliare. Qui descriviamo una modifica del protocollo originale pubblicato da Kruglov e Dranoff 8 per isolare fibroblasti portale da fegato di ratto, fornendo un modo semplice per studiare questa popolazione di cellule in vitro.
Questo approccio utilizza digestione proteasica e basato sulle dimensioni filtrazione. Il principale vantaggio del metodo è che una popolazione di cellule relativamente pura può essere ottenuta senza passaggio in coltura, consentendo lo studio dell'espressione genica o comportamento cellulare funzionale diversi giorni dopo l'isolamento. Questa tecnica offre anche la possibilità di isolare cellule di fegato sani e malati.
Una delle fasi più critiche di questo protocollo è la digestione enzimatica del parenchima epatico. Per garantire la digestione successo, è importante per confermare che il sangue è completamente scarica dal fegato durante la prima perfusionesione facendo in modo che non vi è ancora scottatura del fegato. Per facilitare ciò, è possibile utilizzare un batuffolo di cotone per massaggiare con delicatezza il fegato mentre perfusione. Più-digestione dei risultati parenchima del fegato in una bassa resa di cellule vitali, mentre sotto-digestione renderà difficile separare il parenchima epatico dal dell'albero biliare. Dal momento che le preparazioni di pronasi hanno variabilità dell'attività enzimatica tra lotti differenti, l'ottimizzazione della quantità utilizzata potrebbe essere necessario quando c'è bassa resa di cellule vitali.
Questo protocollo può essere modificato per isolare i fibroblasti portale da fegato di topo o fegato di ratto giovane utilizzando un catetere piccolo calibro IV per incannulare la vena porta, diminuendo il volume di soluzioni di perfusione in proporzione al peso degli animali, e diminuendo la velocità di perfusione del fegato a circa 10 ml / min.
Portal fibroblasti in coltura subiscono differenziazione miofibroblastico in 10-14 giorni, come evidenziato da α-SMA expressione 9. Marcatori sono stati utilizzati vari per distinguere fibroblasti portale da cellule stellate epatiche, incluse fibulin-2, IL-6, elastina, nucleoside trifosfato diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilina-1 e proteine neuronali quali sinaptofisina 2, 6, 10, 11 . Abbiamo scoperto che l'elastina è un buon marcatore per i fibroblasti del portale, anche dopo la differenziazione miofibroblastico, mentre NTPDase2 si perde dopo fibroblasti portale sono stati sottoposti a coltura dopo diversi giorni 9. Pertanto, di solito confermano l'isolamento di fibroblasti portale mediante colorazione per immunofluorescenza elastina.
Il limite di questa tecnica è che, immediatamente dopo l'isolamento portale fibroblasti, vi è una piccola frazione di cellule contaminanti comprese cellule di Kupffer e le cellule biliari. Fibroblasti Portal sarà troppo grande per queste cellule contaminanti nel giro di 2-3 giorni, tuttavia, producendo una popolazione relativamente puro (> 98%) 9.
Since portale fibroblasti in coltura subiscono differenziazione miofibroblastico su plastica di coltura di tessuti, di solito studiano queste cellule entro 7 giorni di isolamento. Le cellule vengono mantenute in mezzi di coltura di fibroblasti portale contenenti 10% di siero fetale bovino, come descritto nella sezione Metodi. Tuttavia, queste cellule sopravviveranno in terreni di coltura contenente 2% di siero fetale bovino per diversi giorni. Noi di solito non usano mezzi a basso siero fino ad almeno 24 ore dopo l'isolamento. Una volta fibroblasti portale subiscono differenziazione miofibroblastico, possono essere diversi passaggi più volte e conservato come stock congelati di miofibroblasti.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH R01 DK05823 (a RGW), F32 DK083213 (a JWW), F30 DK081265 (a ALO), e da una borsa di studio del Fred e Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (a RGW).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |