En teknikk for å isolere portal fibroblaster fra rotteleveren er beskrevet. Livers er perfused og fordøyd<em> In situ</em> Med collagenase, etterfulgt av<em> Ex vivo</em> Fordøyelsen av leveren slurry og størrelsen utvalg av celler. Denne metoden gir en ren populasjon av portalen fibroblaster uten behov for passasje i kultur.
Leverfibrose er definert av overdreven deponering av ekstracellulær matrix ved aktiverte myofibroblasts. Det er flere forløpere til hepatiske myofibroblasts, inkludert hepatiske stellate celler, portal fibroblaster og beinmarg avledet fibroblaster en. Nedsatt stellate celler har vært den beste studert, men portalen fibroblaster blir stadig mer anerkjent som viktige bidragsytere til myofibroblast bassenget, særlig i biliær fibrose to. Portal fibroblaster gjennomgå spredning i respons til biliær epiteliale skade, potensielt spille en nøkkelrolle i de tidlige stadier av biliær arrdannelse 3-5. En metode for å isolere portalen fibroblaster ville tillate in vitro studie av denne cellen befolkningen og føre til større forståelse for den rollen portalen fibroblaster spille i biliær fibrose.
Portal fibroblaster har vært isolert ved hjelp av forskjellige teknikker, inkludert utvekst 6, 7 og Liver perfusjon med enzymatisk fordøyelse etterfulgt av størrelse valg 8. Fordelen med fordøyelse og størrelsen utvalg teknikk i forhold til utvekst teknikken er at cellene kan studeres uten nødvendigheten av passasjen i kulturen. Her beskriver vi en modifisert versjon av den opprinnelige teknikken beskrevet av Kruglov og Dranoff 8 for isolering av portalen fibroblaster fra rotteleveren som resulterer i en relativt ren populasjon av primære celler.
Portal fibroblaster spiller en viktig rolle i biliær fibrose. Her beskriver vi en endring av den opprinnelige protokollen publisert av Kruglov og Dranoff 8 for å isolere portal fibroblaster fra rotteleveren, og gir en grei måte å studere dette cellepopulasjon in vitro.
Denne tilnærmingen bruker protease fordøyelse og størrelse basert filtrering. Den primære fordelen med metoden er at en relativt ren populasjon av celler kan innhentes uten passasje i kultur, slik at studiet av genuttrykk eller funksjonell celle atferd flere dager etter isolasjon. Denne teknikken gir også muligheten for å isolere cellene fra både friske og syke lever.
En av de mest kritiske trinnene i denne protokollen er den enzymatiske fordøyelsen av nedsatt parenchyma. For å sikre en vellykket fordøyelsen, er det viktig å bekrefte at blod er helt tappet ut av leveren under den innledende perfuSion ved å sørge for at det blir enda blanchering av leveren. For å lette dette, er det mulig å bruke en bomullspinne for å massere leveren mens perfusing. Over-fordøyelse av leveren parenchyma resulterer i en lav yield på levedyktige celler, mens under-fordøyelsen vil gjøre det vanskelig å skille leveren parenchyma fra gallen treet. Siden preparater av pronase ha variasjon i enzymaktivitet mellom ulike masse, optimalisering av beløpet som brukes kan være nødvendig når det er lav yield på levedyktige celler.
Denne protokollen kan endres for å isolere portal fibroblaster fra mus lever-eller ung rotte leveren ved hjelp av en mindre måler IV kateter til cannulate portalen blodåre, redusere volumet av perfusjon løsninger i forhold til dyr vekt, og redusere leveren perfusjon satsen til om lag 10 ml / min.
Portal fibroblaster i kultur gjennomgå myofibroblastic differensiering i 10-14 dager, noe som gjenspeiles av α-SMA expression 9. Ulike markører har blitt brukt til å skille portal fibroblaster fra hepatiske stellate celler, inkludert fibulin-2, IL-6, elastin, nukleosid trifosfat diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1 og nevrale proteiner som to synaptophysin, 6, 10, 11 . Vi har funnet at elastin er en god markør for portal fibroblaster, selv etter myofibroblastic differensiering, mens NTPDase2 er tapt etter portal fibroblaster har gjennomgått kultur etter flere dager 9. Derfor har vi vanligvis bekrefte isolering av portalen fibroblaster ved immunfluorescens farging for elastin.
Begrensningen av denne teknikken er at umiddelbart etter portal fibroblast isolasjon, det er en liten brøkdel av forurensende celler, inkludert Kupffer celler og galle celler. Portal fibroblaster vil vokse disse forurensende celler i løpet av 2-3 dager, men som gir en forholdsvis ren befolkning (> 98%) 9.
SiNCE portalen fibroblaster i kultur gjennomgå myofibroblastic differensiering på vevskultur plast, vi vanligvis studere disse cellene innen 7 dager etter isolasjon. Cellene er opprettholdt i portalen fibroblast kultur medier som inneholder 10% fosterets bovint serum, som beskrevet i metoder delen. Imidlertid vil disse cellene overleve i vekstmedier som inneholder 2% fosterets bovint serum i flere dager. Vi vanligvis ikke bruker lave serum media før minst 24 timer etter isolasjon. Når portalen fibroblaster gjennomgå myofibroblastic differensiering, kan de bli passaged flere ganger og holdt som frosne bestander av myofibroblasts.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av NIH R01 DK05823 (til RGW), F32 DK083213 (til JWW), F30 DK081265 (til ALO), og ved en bevilgning fra Fred og Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (til RGW).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |