Uma técnica para o isolamento de fibroblastos portal a partir de fígado de rato é descrito. Os fígados são perfundidos e digerido<em> In situ</em> Com colagenase, seguido por<em> Ex vivo</em> Digestão da lama de fígado e de selecção do tamanho das células. Este método proporciona uma população pura de fibroblastos de portal sem a necessidade de passagem em cultura.
Fibrose hepática é definida pela deposição excessiva de matriz extracelular por miofibroblastos activados. Existem múltiplas de precursores miofibroblastos hepáticas, incluindo as células estreladas hepáticas, fibroblastos de portal e medula óssea fibroblastos derivados 1. Células estreladas hepáticas ter sido melhor estudada, mas fibroblastos portal estão cada vez mais reconhecidos como importantes contribuintes para a piscina de miofibroblastos, particularmente na fibrose biliar 2. Fibroblastos de portal sofrer proliferação em resposta a uma lesão epitelial biliar, potencialmente desempenhando um papel fundamental nos estágios iniciais da cicatrização biliar 3-5. Um método de isolamento de fibroblastos de portal permitiria estudo in vitro desta população de células e conduzir a uma maior compreensão do papel fibroblastos de portal desempenhar na fibrose biliar.
Fibroblastos de portal foram isolados utilizando várias técnicas, incluindo excrescência 6, 7 e liperfusão ver com a digestão enzimática seguida de seleção de tamanho 8. A vantagem da digestão e técnica de selecção de tamanho em comparação com a técnica excrescência é que as células podem ser estudados sem a necessidade de passagem em cultura. Aqui, nós descrevemos uma versão modificada da técnica original descrita por Kruglov e Dranoff 8 para o isolamento de fibroblastos portal a partir de fígado de rato, que resulta em uma população relativamente pura de células primárias.
Fibroblastos de portal desempenhar um papel importante na fibrose biliar. Descrevemos aqui uma modificação do protocolo original publicada por Kruglov e Dranoff 8 para isolar fibroblastos portal a partir de fígado de rato, proporcionando uma maneira simples para estudar esta população de células in vitro.
Esta abordagem utiliza a digestão da protease e baseada no tamanho de filtração. A principal vantagem do método é que uma população relativamente pura de células podem ser obtidas sem a passagem em cultura, permitindo que o estudo da expressão do gene ou o comportamento de células funcional vários dias após o isolamento. Esta técnica também oferece o potencial para isolar células de fígados saudáveis e doentes.
Uma das etapas mais críticas neste protocolo é a digestão enzimática do parênquima hepático. Para assegurar uma digestão sucesso, é importante para confirmar que o sangue é completamente drenado para fora do fígado durante o perfusão inicialSion, certificando-se que há ainda de branqueamento do fígado. Para facilitar isto, é possível usar um cotonete para massagem suave do fígado, enquanto perfundindo. Mais de digestão de os resultados parênquima hepático em um baixo rendimento de células viáveis, enquanto sob a digestão-irá tornar mais difícil separar o parênquima do fígado a partir da árvore biliar. Desde os preparativos de pronase tem variabilidade na atividade enzimática entre diferentes lotes, a otimização da quantidade utilizada pode ser necessária quando há baixa produção de células viáveis.
Este protocolo pode ser modificada para isolar fibroblastos portal a partir de fígado de rato ou do fígado de ratos jovens usando uma menor bitola cateter IV para canular a veia portal, diminuindo o volume das soluções de perfusão em proporção ao peso do animal, e diminuindo a taxa de perfusão do fígado e cerca de 10 ml / min.
Fibroblastos em cultura de portal sofrem diferenciação miofibroblástico em 10-14 dias, como evidenciado por α-SMA expressão 9. Vários marcadores têm sido utilizados para distinguir os fibroblastos de portal a partir de células estreladas hepáticas, incluindo fibulin-2, IL-6, elastina, nucleósido-trifosfato difosfohidrolase-2 (NTPDase2), cofilina-1 e proteínas neuronais, tais como sinaptofisina 2, 6, 10, 11 . Nós descobrimos que a elastina é um bom marcador para fibroblastos de portal, mesmo após a diferenciação miofibroblástico, enquanto NTPDase2 é perdido após fibroblastos de portal tenham sido submetidos a cultura, após vários dias 9. Portanto, nós tipicamente confirmar o isolamento de fibroblastos portal pela técnica de imunofluorescência para elastina.
A limitação desta técnica é que, imediatamente após o isolamento de fibroblastos de portal, existe uma pequena fracção de contaminar células incluindo células de Kupffer e células biliares. Fibroblastos de portal outgrow estas células contaminantes dentro de 2-3 dias, no entanto, obtendo-se uma população relativamente puro (> 98%) 9.
Since fibroblastos do portal de cultura sofrem diferenciação miofibroblástico em plástico de cultura de tecido, que normalmente estudar estas células dentro de 7 dias de isolamento. As células são mantidas em meios de fibroblastos de portal de cultura contendo 10% de soro fetal bovino, como descrito na secção Métodos. No entanto, estas células irão sobreviver no meio de crescimento contendo 2% de soro fetal de bovino durante vários dias. Nós normalmente não usam meios de baixo custo de soro até pelo menos 24 horas após o isolamento. Uma vez que os fibroblastos de portal sofrem diferenciação miofibroblástico, eles podem ser passadas várias vezes e mantidos como stocks congelados de miofibroblastos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 DK05823 (para RGW), F32 DK083213 (para JWW), F30 DK081265 (para ALO), e por uma concessão do Fred e Biesecker Suzanne Liver Center Pediátrica (para RGW).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |