Onderzoeken darmontsteking in DSS-geïnduceerde Model van IBD

Summary

Experimentele modellen van inflammatoire darmziekte hebben ons de complexe aangeboren en adaptieve immuunrespons geassocieerd met pathogenese te onderzoeken. Met behulp van histologische scoring, kwantificering van pro-inflammatoire cytokines en myeloperoxidase activiteit, kan men beginnen met deze reacties gezien bij inflammatoire darmziekten te beoordelen.

Abstract

Inflammatoire darmziekte (IBD) omvat een reeks van intestinale aandoeningen, de meest voorkomende daarvan zijn colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD). Zowel de UC en CD, indien aanwezig in de dikke darm, een soortgelijk symptoom profiel dat diarree, rectaal bloeden, buikpijn en gewichtsverlies kunnen bestaan ​​uit genereren. ¹ Hoewel de pathogenese van IBD nog onbekend is, wordt beschreven als een multifactoriële ziekte die zowel betrekking genetische en omgevingsfactoren componenten. ²

Er zijn talrijke en variabele diermodellen van de dikke darm ontsteking die lijken op een aantal kenmerken van IBD. Diermodellen van colitis variëren van ontstaan ​​spontaan in gevoelige stammen van bepaalde soorten aan die bestanddelen die de toediening van specifieke concentraties van colitis-inducerende chemische stoffen, zoals dextran sulfaat natrium (DSS). Chemisch-geïnduceerde modellen van de darm ontsteking zijn de meest gebruikte en beste omschreven modellen van IBD. Administratie van DSS in het drinkwater produceert acute of chronische colitis, afhankelijk van de administratie-protocol. ³ dieren gegeven DSS vertonen gewichtsverlies en tekenen van losse ontlasting of diarree, soms met het bewijs van rectale bloeden. ^4,5 Hier beschrijven we de methoden waarmee colitis ontwikkeling en de daaruit voortvloeiende ontstekingsreactie kan worden gekenmerkt na toediening van DSS. Deze methoden omvatten histologische analyse van hematoxyline / eosine gekleurde dikke delen, meting van pro-inflammatoire cytokines, en de bepaling van myeloperoxidase (MPO) activiteiten, die gebruikt kan worden als een surrogaat marker van ontsteking. ⁶

De omvang van de ontstekingsreactie bij de ziekte van de staat kan worden beoordeeld door de aanwezigheid van klinische symptomen of door verandering in de histologie in mucosale weefsels. Colonic histologische schade wordt beoordeeld door middel van een scoresysteem dat het verlies van de crypte architectuur, inflammatoire cel infiltratie, spier t beschouwthickening, beker-cel depletie, en crypte abces. ⁷ kwantitatief, kan het niveau van pro-inflammatoire cytokines met acute inflammatoire eigenschappen, zoals interleukine (IL)-1β, IL-6 en tumor necrosis factor (TNF)-α, worden bepaald met behulp van conventionele ELISA methoden. Daarnaast kan MPO-activiteit worden gemeten met behulp van een colorimetrische assay en gebruikt als een index van een ontsteking. ⁸

In experimentele colitis, is ernst van de ziekte vaak gecorreleerd met een toename van de MPO-activiteit en hogere niveaus van pro-inflammatoire cytokines. Colitis ernst en ontsteking-gerelateerde schade kan worden beoordeeld door na te gaan consistentie van de ontlasting en bloeden, in aanvulling op de beoordeling van de histopathologische toestand van de darm met behulp van hematoxyline / eosine gekleurde colon weefselcoupes. Colonic weefsel fragmenten kunnen worden gebruikt om de MPO activiteit en cytokine productie te bepalen. Tezamen kunnen deze maatregelen worden gebruikt om de intestinale ontstekingsreactie in te evaluerendiermodellen van experimentele colitis.

Protocol

1. Muizenmodel van DSS-geïnduceerde acute colitis Voeg dextraansulfaat natrium (DSS) om geautoclaveerd drinkwater aan de gewenste uiteindelijke concentratie (1-5%) (wt / vol) (dwz een 5% DSS-oplossing te maken, 25 mg DSS poeder tot 500 ml van geautoclaveerd water toe te voegen) . Stock oplossing kan worden ingeleverd bij kamertemperatuur gedurende maximaal een week of bij 4 ° C tot gebruik. In een bioveiligheid kap, giet voorraad DSS-oplossing in 50 ml Falcon buizen (een die nodig is per kooi). Ho…

Discussion

DSS colitis is een veel gebruikte chemisch geïnduceerde model van intestinale ontsteking. In dit model, muizen krijgen het drinkwater aangevuld met DSS, dat wordt gedacht dat zij giftig voor epitheelcellen darm en de integriteit van de mucosale barrière te verstoren. ¹⁰ Toediening van DSS induceert een acute colitis die wordt gekenmerkt door losse ontlasting, fecale bloeden, en infiltratie met granulocyten. ¹⁰ Tijdens DSS toediening wordt colitis meestal geassocieerd met significant gewichtsverli…

Materials

Name of reagent/equipment:	Company	Catalogue number	Comments
Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL)	eppendorf	0030 120.094
Biotek EL808 Absorbance plate reader	Biotek	EL808
Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da)	MP Biomedicals	160110
Gen5 (software)	Biotek	Version 1.10.8
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB)	Sigma-Aldrich	H5882-100G
Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water	Sigma-Aldrich	216763	Store at 2-8°C
Microtest plate 96-well flat bottom	Sarstedt	82.1581	For single use only
o-Dianisidine	Sigma-Aldrich	D-3252	Light sensitive. Store at 2-8°C
Potassium phosphate, dibasic	Caledon	6620-1
Potassium phosphate, monobasic	EMD Chemicals	PX1565-1
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Store at -20°C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II	QUIAGEN	69997