Summary

Onderzoeken darmontsteking in DSS-geïnduceerde Model van IBD

Published: February 01, 2012
doi:

Summary

Experimentele modellen van inflammatoire darmziekte hebben ons de complexe aangeboren en adaptieve immuunrespons geassocieerd met pathogenese te onderzoeken. Met behulp van histologische scoring, kwantificering van pro-inflammatoire cytokines en myeloperoxidase activiteit, kan men beginnen met deze reacties gezien bij inflammatoire darmziekten te beoordelen.

Abstract

Inflammatoire darmziekte (IBD) omvat een reeks van intestinale aandoeningen, de meest voorkomende daarvan zijn colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD). Zowel de UC en CD, indien aanwezig in de dikke darm, een soortgelijk symptoom profiel dat diarree, rectaal bloeden, buikpijn en gewichtsverlies kunnen bestaan ​​uit genereren. 1 Hoewel de pathogenese van IBD nog onbekend is, wordt beschreven als een multifactoriële ziekte die zowel betrekking genetische en omgevingsfactoren componenten. 2

Er zijn talrijke en variabele diermodellen van de dikke darm ontsteking die lijken op een aantal kenmerken van IBD. Diermodellen van colitis variëren van ontstaan ​​spontaan in gevoelige stammen van bepaalde soorten aan die bestanddelen die de toediening van specifieke concentraties van colitis-inducerende chemische stoffen, zoals dextran sulfaat natrium (DSS). Chemisch-geïnduceerde modellen van de darm ontsteking zijn de meest gebruikte en beste omschreven modellen van IBD. Administratie van DSS in het drinkwater produceert acute of chronische colitis, afhankelijk van de administratie-protocol. 3 dieren gegeven DSS vertonen gewichtsverlies en tekenen van losse ontlasting of diarree, soms met het bewijs van rectale bloeden. 4,5 Hier beschrijven we de methoden waarmee colitis ontwikkeling en de daaruit voortvloeiende ontstekingsreactie kan worden gekenmerkt na toediening van DSS. Deze methoden omvatten histologische analyse van hematoxyline / eosine gekleurde dikke delen, meting van pro-inflammatoire cytokines, en de bepaling van myeloperoxidase (MPO) activiteiten, die gebruikt kan worden als een surrogaat marker van ontsteking. 6

De omvang van de ontstekingsreactie bij de ziekte van de staat kan worden beoordeeld door de aanwezigheid van klinische symptomen of door verandering in de histologie in mucosale weefsels. Colonic histologische schade wordt beoordeeld door middel van een scoresysteem dat het verlies van de crypte architectuur, inflammatoire cel infiltratie, spier t beschouwthickening, beker-cel depletie, en crypte abces. 7 kwantitatief, kan het niveau van pro-inflammatoire cytokines met acute inflammatoire eigenschappen, zoals interleukine (IL)-1β, IL-6 en tumor necrosis factor (TNF)-α, worden bepaald met behulp van conventionele ELISA methoden. Daarnaast kan MPO-activiteit worden gemeten met behulp van een colorimetrische assay en gebruikt als een index van een ontsteking. 8

In experimentele colitis, is ernst van de ziekte vaak gecorreleerd met een toename van de MPO-activiteit en hogere niveaus van pro-inflammatoire cytokines. Colitis ernst en ontsteking-gerelateerde schade kan worden beoordeeld door na te gaan consistentie van de ontlasting en bloeden, in aanvulling op de beoordeling van de histopathologische toestand van de darm met behulp van hematoxyline / eosine gekleurde colon weefselcoupes. Colonic weefsel fragmenten kunnen worden gebruikt om de MPO activiteit en cytokine productie te bepalen. Tezamen kunnen deze maatregelen worden gebruikt om de intestinale ontstekingsreactie in te evaluerendiermodellen van experimentele colitis.

Protocol

1. Muizenmodel van DSS-geïnduceerde acute colitis Voeg dextraansulfaat natrium (DSS) om geautoclaveerd drinkwater aan de gewenste uiteindelijke concentratie (1-5%) (wt / vol) (dwz een 5% DSS-oplossing te maken, 25 mg DSS poeder tot 500 ml van geautoclaveerd water toe te voegen) . Stock oplossing kan worden ingeleverd bij kamertemperatuur gedurende maximaal een week of bij 4 ° C tot gebruik. In een bioveiligheid kap, giet voorraad DSS-oplossing in 50 ml Falcon buizen (een die nodig is per kooi). Ho…

Discussion

DSS colitis is een veel gebruikte chemisch geïnduceerde model van intestinale ontsteking. In dit model, muizen krijgen het drinkwater aangevuld met DSS, dat wordt gedacht dat zij giftig voor epitheelcellen darm en de integriteit van de mucosale barrière te verstoren. 10 Toediening van DSS induceert een acute colitis die wordt gekenmerkt door losse ontlasting, fecale bloeden, en infiltratie met granulocyten. 10 Tijdens DSS toediening wordt colitis meestal geassocieerd met significant gewichtsverli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) en door de ziekte van Crohn en Colitis Foundation of Canada (CCFC).

Materials

Name of reagent/equipment: Company Catalogue number Comments
Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL) eppendorf 0030 120.094  
Biotek EL808 Absorbance plate reader Biotek EL808  
Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da) MP Biomedicals 160110  
Gen5 (software) Biotek Version 1.10.8  
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G  
Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water Sigma-Aldrich 216763 Store at 2-8°C
Microtest plate 96-well flat bottom Sarstedt 82.1581 For single use only
o-Dianisidine Sigma-Aldrich D-3252 Light sensitive. Store at 2-8°C
Potassium phosphate, dibasic Caledon 6620-1  
Potassium phosphate, monobasic EMD Chemicals PX1565-1  
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Store at -20°C
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787  
Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II QUIAGEN 69997  

References

  1. Sands, B. E. From symptom to diagnosis: clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation. Gastroenterology. 126, 1518-1532 (2004).
  2. Danese, S., Fiocchi, C. Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases. World J. Gastroenterol. 12, 4807-4812 (2006).
  3. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).
  4. Axelsson, L. G., Landstrom, E., Goldschmidt, T. J., Gronberg, A., Bylund-Fellenius, A. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+)-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflamm. Res. 45, 181-191 (1996).
  5. Egger, B., Bajaj-Elliott, M., MacDonald, T. T., Inglin, R., Eysselein, V. E., Büchler, M. W. Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis: cytokine profile and dose dependency. Digestion. 62, 240-248 (2000).
  6. Krawisz, J. E., Sharon, P., Stenson, W. F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models. Gastroenterology. 87, 1344-1350 (1984).
  7. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab. Invest. 69, 238-249 (1993).
  8. Smith, J. W., Castro, G. A. Relation of peroxidase activity in gut mucosa to inflammation. Am. J. Physiol. 234, R72-R79 (1978).
  9. Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Kumar-Ondiveeran, H., Verdu, E. F., Collins, S. M. The vagus nerve: a tonic inhibitory influence associated with inflammatory bowel disease in a murine model. Gastroenterology. 131, 1122-1130 (2006).
  10. Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., Nakaya, R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98, 694-702 (1990).
  11. Solomon, L., Mansor, S., Mallon, P., Donnelly, E., Hoper, M., Loughrey, M., Kirk, S., Gardiner, K. The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview. Comparative Clinical Pathology. 19, 235-239 (2010).
  12. Mähler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am. J. Physiol. 274, G544-G551 (1998).
  13. Hans, W., Scholmerich, J., Gross, V., Falk, W. The role of the resident intestinal flora in acute and chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 12, 267-273 (2000).
  14. Rath, H. C., Schultz, M., Freitag, R., Dieleman, L. A., Li, F., Linde, H., Schölmerich, J., Sartor, R. B. Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice. Infect. Immun. 69, 2277-2285 (2001).
  15. Ghia, J. E., Li, N., Wang, H., Collins, M., Deng, Y., El-Sharkawy, R. T., Côté, F., Mallet, J., Khan, W. I. Serotonin has a key role in pathogenesis of experimental colitis. Gastroenterology. 137, 1649-1660 (2009).
  16. Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance. J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).
  17. Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice. Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).

Play Video

Cite This Article
Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).

View Video