Undersöka tarminflammation i DSS-inducerad modell av IBD

Summary

Experimentella modeller för inflammatoriska tarmsjukdomar har tillåtit oss att undersöka de komplexa medfödda och adaptiva immunsvaret i samband med patogenes. Använda histologisk scoring, kvantifiering av proinflammatoriska cytokiner och myeloperoxidas aktivitet, kan man börja utvärdera dessa svar ses vid inflammatorisk tarmsjukdom.

Abstract

Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) omfattar en rad tarm sjukdomar, den vanligaste av dessa är ulcerös kolit (UC) och Crohns sjukdom (CD). Både UC och CD, när de förekommer i tjocktarmen, generera en liknande symptom profil som kan innefatta diarré, rektal blödning, buksmärtor och viktnedgång. ¹ Även om patogenesen för IBD är okänd, är det beskrivs som en multifaktoriell sjukdom som innebär både genetiska och miljömässiga komponenter. ²

Det finns många och varierande djurmodeller av kolon inflammation som liknar flera funktioner i IBD. Djurmodeller av kolit varierar från dem som uppstår spontant hos känsliga stammar av vissa arter som kräver tillförsel av vissa koncentrationer av kolit-inducerande ämnen, som t.ex. dextransulfat natrium (DSS). Kemisk-inducerad modeller av tarmen inflammation är de vanligaste och bäst beskrivna modeller av IBD. Administrastration av DSS i dricksvatten med akut eller kronisk kolit, beroende på förvaltningen protokollet. ³ djur som fått DSS uppvisar viktnedgång och tecken på lös avföring eller diarré, ibland med tecken på blödning. ^4,5 Här beskriver vi de metoder som kolit utveckling och den resulterande inflammatorisk reaktion kan karakteriseras efter administrering av DSS. Dessa metoder omfattar histologiska analysen av hematoxylin / eosin färgade kolon delar, mätning av proinflammatoriska cytokiner och bestämning av myeloperoxidas (MPO) aktivitet, som kan användas som ett surrogat markör för inflammation. ⁶

Omfattningen av det inflammatoriska svaret i sjukdomstillstånd kan bedömas genom förekomsten av kliniska symtom eller genom förändring i histologi i slemhinne. Kolon histologiska skador bedöms med hjälp av ett poängsystem som anser förlusten av kryptan arkitektur, inflammatorisk cell infiltration, muskel thickening, bägare cellbristen och krypta abscess. ⁷ Kvantitativt sett kan nivåerna av proinflammatoriska cytokiner med akuta inflammatoriska egenskaper, såsom interleukin (IL)-1β, IL-6 och tumor necrosis factor (TNF)-α, bestämmas med hjälp konventionell ELISA-metoder. Dessutom kan MPO aktivitet mätas med hjälp av en kolorimetrisk analys och användas som ett index på inflammation. ⁸

I experimentella kolit är sjukdomens svårighetsgrad ofta korrelerade med en ökning av MPO-aktivitet och högre nivåer av proinflammatoriska cytokiner. Kolit svårighetsgrad och inflammation-associerade skador kan bedömas genom att undersöka avföringen konsistens och blödning, förutom att bedöma histopatologiska tillståndet i tarmen med hjälp av hematoxylin / eosin färgade kolon vävnadssnitt. Kolon vävnad fragment kan användas för att bestämma MPO aktivitet och cytokin produktion. Sammantaget kan dessa åtgärder användas för att utvärdera den intestinala inflammatorisk reaktion idjurmodeller av experimentell kolit.

Protocol

1. Murina modell av DSS-inducerad akut kolit Lägg dextransulfat natrium (DSS) för att autoklaveras dricksvatten till önskad slutliga koncentrationen (1-5%) (vikt / vol) (dvs att göra en 5% DSS lösning tillsätts 25 mg DSS pulver till 500 ml autoklaveras vatten) . Stamlösning kan lämnas i rumstemperatur i upp till en vecka eller vid 4 ° C fram till användning. I en biosäkerhet huva, häll lösningen lager DSS i 50 ml Falcon rör (ett behov per bur). Håll stamlösning för att fylla rören …

Discussion

DSS kolit är en allmänt använd kemiskt inducerad modell av tarminflammation. I denna modell är möss som fick dricksvatten kompletteras med DSS, som tros vara giftiga för tarmen epitelceller och störa integritet slemhinnor barriären. ¹⁰ Administrering av DSS framkallar en akut kolit som kännetecknas av lös avföring, avföring blödning, och infiltration med granulocyter. ¹⁰ Under DSS administrering kolit vanligtvis förknippas med betydande viktminskning och förekomst av blod i avföring…

Materials

Name of reagent/equipment:	Company	Catalogue number	Comments
Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL)	eppendorf	0030 120.094
Biotek EL808 Absorbance plate reader	Biotek	EL808
Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da)	MP Biomedicals	160110
Gen5 (software)	Biotek	Version 1.10.8
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB)	Sigma-Aldrich	H5882-100G
Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water	Sigma-Aldrich	216763	Store at 2-8°C
Microtest plate 96-well flat bottom	Sarstedt	82.1581	For single use only
o-Dianisidine	Sigma-Aldrich	D-3252	Light sensitive. Store at 2-8°C
Potassium phosphate, dibasic	Caledon	6620-1
Potassium phosphate, monobasic	EMD Chemicals	PX1565-1
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Store at -20°C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II	QUIAGEN	69997