Summary

Undersøgelse tarmbetændelse i DSS-induceret Model af IBD

Published: February 01, 2012
doi:

Summary

Eksperimentelle modeller af inflammatorisk tarmsygdom har tilladt os at undersøge det komplekse medfødte og adaptive immunrespons i forbindelse med patogenese. Ved hjælp af histologiske scoring, kvantificering af pro-inflammatoriske cytokiner og myeloperoxidase aktivitet, kan man begynde at vurdere disse svar ses i inflammatorisk tarmsygdom.

Abstract

Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) omfatter en række af tarm sygdomme, de mest almindelige af dem er colitis ulcerosa (UC) og Crohns sygdom (CD). Både UC og CD, når de findes i tyktarmen, generere en lignende symptom profil, der kan omfatte diarré, blødning fra endetarmen, mavesmerter og vægttab. 1 Selv om patogenesen af IBD er fortsat ukendt, er det beskrevet som en multifaktoriel sygdom, der involverer både genetiske og miljømæssige komponenter. 2

Der er mange og varierende dyremodeller af colon inflammation, der ligner flere funktioner af IBD. Dyremodeller af colitis spænder fra dem, der opstår spontant i følsomme stammer af visse arter til dem, der kræver administration af bestemte fusioner af colitis-inducerende kemikalier, som f.eks dextransulfat natrium (DSS). Kemisk-inducerede modeller af tarmen inflammation er den mest udbredte og bedst beskrives modeller af IBD. Adminidemonstration af DSS i drikkevandet producerer akut eller kronisk colitis, afhængigt af administrationen protokollen. 3 dyr, der fik DSS udviser vægttab og tegn på tynd afføring eller diarré, undertiden med tegn på blødning fra endetarmen. 4,5 Her beskriver vi de metoder, hvormed colitis udvikling og den deraf følgende inflammatoriske respons kan karakteriseres efter administration af DSS. Disse metoder omfatter histologisk analyse af hæmatoxylin / eosin farves kolon sektioner, måling af pro-inflammatoriske cytokiner, og bestemmelse af myeloperoxidase (MPO) aktivitet, som kan bruges som et surrogat markør for inflammation. 6

Omfanget af den inflammatoriske reaktion i sygdommen tilstand kan vurderes ved tilstedeværelse af kliniske symptomer eller ved ændring i histologi i slimhindevævet. Colon histologiske skader vurderes ved hjælp af et pointsystem, der betragter tab af krypt arkitektur, inflammatoriske celleinfiltration, muskel thickening, bæger celle depletion og krypt byld. 7 Kvantitativt kan niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner med akut inflammatoriske egenskaber, såsom interleukin (IL)-1β, IL-6 og tumornekrosefaktor (TNF)-α, bestemmes ved hjælp af konventionelle ELISA-metoder. Desuden kan MPO aktivitet måles ved hjælp af en kolorimetrisk analyse og bruges som et indeks af inflammation. 8

I eksperimentel colitis, er sygdommens sværhedsgrad ofte er korreleret med en stigning i MPO aktivitet og højere niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner. Colitis sværhedsgrad og betændelse-relaterede skader kan vurderes ved at undersøge afføring konsekvens og blødning, udover at vurdere den histopatologiske tilstand af tarmen ved hjælp af hæmatoxylin / eosin farves colonic vævssnit. Colon væv fragmenter kan bruges til at bestemme MPO aktivitet og cytokin produktion. Tilsammen kan disse foranstaltninger anvendes til at vurdere den intestinale inflammatorisk respons idyremodeller for eksperimentel colitis.

Protocol

1. Murine model af DSS-induceret akut colitis Tilføj dextransulfat natrium (DSS) til autoklaveret drikkevand til den ønskede slutkoncentration (1-5%) (wt / vol) (dvs. at gøre en 5% DSS løsning, tilsættes 25 mg af DSS pulver til 500 ml autoklaveret vand) . Stamopløsning kan stå ved stuetemperatur i op til en uge eller ved 4 ° C indtil brug. I et biosikkerhed hætte, hæld lager DSS opløsning i 50 ml Falcon rør (en nødvendig pr bur). Hold stamopløsning at genopfylde rør når det er nødve…

Discussion

DSS colitis er en meget anvendt kemisk induceret model af tarmbetændelse. I denne model er mus, der fik drikkevand suppleret med DSS, som menes at være giftige for tarm epitel celler og forstyrre integritet mucosal barriere. 10 Administration af DSS inducerer et akut colitis, der er karakteriseret ved løs afføring, fækal blødning, og infiltration med granulocytter. 10 Under DSS administration er colitis normalt forbundet med signifikant vægttab og tilstedeværelse af blod i afføringen, hvil…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde er støttet af tilskud fra Canadian Institutes of Health Research (CIHR) og Crohns og Colitis Foundation of Canada (CCFC).

Materials

Name of reagent/equipment: Company Catalogue number Comments
Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL) eppendorf 0030 120.094  
Biotek EL808 Absorbance plate reader Biotek EL808  
Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da) MP Biomedicals 160110  
Gen5 (software) Biotek Version 1.10.8  
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G  
Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water Sigma-Aldrich 216763 Store at 2-8°C
Microtest plate 96-well flat bottom Sarstedt 82.1581 For single use only
o-Dianisidine Sigma-Aldrich D-3252 Light sensitive. Store at 2-8°C
Potassium phosphate, dibasic Caledon 6620-1  
Potassium phosphate, monobasic EMD Chemicals PX1565-1  
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Store at -20°C
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787  
Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II QUIAGEN 69997  

References

  1. Sands, B. E. From symptom to diagnosis: clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation. Gastroenterology. 126, 1518-1532 (2004).
  2. Danese, S., Fiocchi, C. Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases. World J. Gastroenterol. 12, 4807-4812 (2006).
  3. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).
  4. Axelsson, L. G., Landstrom, E., Goldschmidt, T. J., Gronberg, A., Bylund-Fellenius, A. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+)-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflamm. Res. 45, 181-191 (1996).
  5. Egger, B., Bajaj-Elliott, M., MacDonald, T. T., Inglin, R., Eysselein, V. E., Büchler, M. W. Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis: cytokine profile and dose dependency. Digestion. 62, 240-248 (2000).
  6. Krawisz, J. E., Sharon, P., Stenson, W. F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models. Gastroenterology. 87, 1344-1350 (1984).
  7. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab. Invest. 69, 238-249 (1993).
  8. Smith, J. W., Castro, G. A. Relation of peroxidase activity in gut mucosa to inflammation. Am. J. Physiol. 234, R72-R79 (1978).
  9. Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Kumar-Ondiveeran, H., Verdu, E. F., Collins, S. M. The vagus nerve: a tonic inhibitory influence associated with inflammatory bowel disease in a murine model. Gastroenterology. 131, 1122-1130 (2006).
  10. Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., Nakaya, R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98, 694-702 (1990).
  11. Solomon, L., Mansor, S., Mallon, P., Donnelly, E., Hoper, M., Loughrey, M., Kirk, S., Gardiner, K. The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview. Comparative Clinical Pathology. 19, 235-239 (2010).
  12. Mähler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am. J. Physiol. 274, G544-G551 (1998).
  13. Hans, W., Scholmerich, J., Gross, V., Falk, W. The role of the resident intestinal flora in acute and chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 12, 267-273 (2000).
  14. Rath, H. C., Schultz, M., Freitag, R., Dieleman, L. A., Li, F., Linde, H., Schölmerich, J., Sartor, R. B. Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice. Infect. Immun. 69, 2277-2285 (2001).
  15. Ghia, J. E., Li, N., Wang, H., Collins, M., Deng, Y., El-Sharkawy, R. T., Côté, F., Mallet, J., Khan, W. I. Serotonin has a key role in pathogenesis of experimental colitis. Gastroenterology. 137, 1649-1660 (2009).
  16. Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance. J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).
  17. Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice. Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).

Play Video

Cite This Article
Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).

View Video