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Biology

IBD के DSS प्रेरित मॉडल में आंत्र शोथ जांच

doi: 10.3791/3678 Published: February 1, 2012

Summary

सूजन आंत्र रोग के प्रायोगिक मॉडल हमें जटिल जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा रोगजनन के साथ जुड़े प्रतिक्रियाओं की जांच करने की अनुमति दी है. Histological स्कोरिंग, समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स और myeloperoxidase गतिविधि की मात्रा का ठहराव का उपयोग, एक सूजन आंत्र रोग में देखा करने के लिए इन प्रतिक्रियाओं का आकलन शुरू कर सकते हैं.

Protocol

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1. इस के बारे प्रेरित तीव्र बृहदांत्रशोथ के murine मॉडल

  1. Autoclaved पीने के पानी के लिए वांछित अंतिम एकाग्रता (1-5%) (wt खंड /) (यानी एक 5% DSS समाधान बनाने के लिए, autoclaved पानी की 500 एमएल DSS पाउडर के 25 मिलीग्राम जोड़) dextran सल्फेट सोडियम (DSS) जोड़ें . स्टॉक समाधान कमरे के तापमान पर छोड़ा जा सकता है अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए या 4 में उपयोग ° जब तक सी.
  2. एक जैव सुरक्षा हुड में 50 एमएल फाल्कन ट्यूबों (एक पिंजरे प्रति आवश्यक) में शेयर DSS समाधान डालना. शेयर फिर से भरना ट्यूबों के लिए हल जब जरूरत रखें.
  3. प्रत्येक माउस पिंजरे में DSS समाधान (50 एमएल फाल्कन ट्यूबों में) के साथ पीने के पानी बदलें (अवधि DSS आहार है कि प्रयोग किया जाता है पर निर्भर करता है उदाहरण के लिए, 6-8 हफ्ते पुरानी पुरुष C57BL 6 / चूहों का उपयोग कर, हम प्रशासन होगा. पांच दिन के एक कुल के लिए 5% DSS समाधान). चूहे किसी अन्य पानी के स्रोत के लिए उपयोग नहीं होना चाहिए. नियंत्रण चूहों DSS के बिना autoclaved पीने के पानी दिया जाता है.
  4. दैनिक चूहों का वजन और DSS की राशि प्रति दिन खपत रिकॉर्ड. प्रत्येक शीर्षDSS स्तर रिकॉर्डिंग के बाद 50 एमएल की बोतल. इस प्रयोग की अवधि भर में माउस प्रति पिंजरे प्रति भस्म DSS की अनुमानित मात्रा को मापने के है. हमारे अध्ययन में, हम पुरुष C57BL / 6 चूहों के साथ 5 दिनों के लिए एक 5% DSS समाधान का उपयोग करें. महत्वपूर्ण वजन घटाने, बदल मल स्थिरता और fecal रक्त का संकेत 3 दिन के रूप में जल्दी इस विशेष DSS आहार का उपयोग कर के रूप में देखा जाता है. DSS प्रशासन के दौरान, चूहों निर्जलीकरण और दस्त के साथ वजन घटाने (5 दिन अपने प्रारंभिक वजन के 5-10% के आसपास) के साथ स्पष्ट वजन घटाने प्रारंभिक वजन के 20% से अधिक प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण शारीरिक संकेत है कि एक जानवर या कम है endpoint के निकट. यदि पशु 5% DSS के 5 दिनों के बाद सामान्य पानी का उपयोग करने दिया जाता है, यह 7 दिनों के भीतर ठीक हो जाएगा. सभी प्रयोगों संस्था जानवर नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए और मंजूरी दे दी पशु उपयोगिता प्रोटोकॉल (AUP) के अनुसार हो.
  5. प्रयोग है, एक रोग गतिविधि सूचकांक (दाई) की अवधि के दौरानस्कोर बृहदांत्रशोथ के नैदानिक ​​प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है. दाई वजन घटाने के संयुक्त प्रारंभिक वजन, मल स्थिरता, और खून बह रहा करने के लिए तुलना स्कोर है. स्कोर के रूप में परिभाषित कर रहे हैं: वजन घटाने: 0 (कोई नुकसान नहीं), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%), और 4 (> 20%), मल स्थिरता: 0 (सामान्य), 2 (ढीला मल), और 4 (दस्त), और खून बह रहा: 0 (कोई रक्त), 1 (Hemoccult सकारात्मक), 2 (Hemoccult सकारात्मक और दृश्य गोली खून बह रहा है), और 4 (सकल खून बह रहा, रक्त के आसपास गुदा). दाई DSS उपचार की अवधि के दौरान दैनिक रन कर सकते हैं.
  6. चुनाव के समय बिंदु पर, वजन और चूहों बलिदान. चूहे isoflurane या अन्य संस्था जानवर सुविधा द्वारा अनुमोदित विधि की साँस लेना के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से euthanized किया जा सकता है.

2. Colonic ऊतक के नमूने ले लीजिए

  1. जानवर के ventral पक्ष बेनकाब और एक 70% इथेनॉल समाधान के साथ पेट क्षेत्र गीला. इस बिंदु पर, तालिका 1 के लिए उल्लेख और एक के नोट बनानेमलाशय (गुदा छिद्र में मौजूद रक्त) खून बह रहा है या प्रत्येक जानवर में मलाशय आगे को बढ़ाव की ny संकेत.
  2. मानक विदारक कैंची का प्रयोग एक वेंट्रल midline चीरा करके पेट काटकर अलग कर देना है.
  3. बृहदान्त्र जानें, और बृहदान्त्र के रूप में कोलोरेक्टल मार्जिन के करीब संभव के रूप में बाहर का बृहदान्त्र मुक्त करने के लिए आड़ा काट.
  4. ध्यान से और धीरे धीरे पूरे बृहदान्त्र बाहर खींच, यह आसपास के अन्त्रपेशी से detaching.
  5. आड़ा काट colonocecal मार्जिन पर बृहदान्त्र बृहदान्त्र के प्रॉक्सिमल अंत मुक्त. मल बाँझ पीबीएस के साथ बृहदान्त्र rinsing द्वारा एक नलिका - पोषण ध्यान से यह निचोड़ तुला चिमटी / संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके एक 3 या 5 एमएल सिरिंज या संलग्न सुई का उपयोग करके हटाया जा सकता है. पूरे बृहदान्त्र का प्रयोग, क्षति के लिए आकलन (3.1 खंड देखें)
  6. Histological विश्लेषण और अन्य assays के लिए ऊतक के नमूने 1.0 सेमी लंबे colonic टुकड़े के लिए 0.5 सेमी काटने कृपया ध्यान दें जो क्षेत्र का नमूना है बनाने के द्वारा किया जा सकता है (यानी, प्रॉक्सिमल, मध्यम, या बाहर का).
  7. ऊतकों के नमूनोंके लिए इस्तेमाल किया जा के लिए assays के व्यक्तिगत 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में रखा जा सकता है और तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और -70 पर उपयोग डिग्री सेल्सियस तक संग्रहीत

3. बृहदांत्रशोथ गंभीरता का आकलन

  1. Macroscopic या बीमारी की गंभीरता स्कोर टर्मिनली पहले प्रकाशित स्कोरिंग प्रणाली (तालिका 1) का उपयोग कर एक निष्पक्ष पर्यवेक्षक द्वारा मूल्यांकन 9 स्टूल स्थिरता संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए और मल पर नीचे दबाने निरंतरता निर्धारित द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है है. मल में रक्त के लिए एक स्कोर निर्धारित करने के लिए, मल का रंग नोट (यानी काले मल बनाम हल्के भूरे रंग मल) और आगे एक Hemoccult परीक्षण का उपयोग मान्य. स्कोरिंग प्रणाली का प्रयोग, शर्तों के प्रत्येक के लिए एक स्कोर निर्धारित करते हैं. प्रत्येक जानवर के लिए अंतिम macroscopic स्कोर प्रत्येक व्यक्ति स्कोर का योग है.
  2. बृहदांत्रशोथ गंभीरता के histological नुकसान का मूल्यांकन करने के लिए, बृहदान्त्र के एक छोटे (0.5 सेमी) टुकड़ा, एक ऊतक कैसेट में जगह और बफर 10% formalin समाधान में डूब में कटौती. 5 तैयारसुक्ष्ममापी आयल पार वर्गों और / hematoxylin eoxin (एच एंड ई) के साथ दाग वर्गों उचित प्रक्रिया का उपयोग कर एम्बेडेड. Colon टुकड़े प्रॉक्सिमल, बृहदान्त्र के मध्य, या बृहदान्त्र के बाहर अनुभाग से लिया जा सकता है.
  3. एच और ई दाग colonic ऊतक वर्गों एक अंधा निम्नलिखित उपायों के लिए एक पहले प्रकाशित प्रणाली का उपयोग पर्यवेक्षक द्वारा बने हैं: (- गंभीर पूरे तहखाने, 3 की हानि के साथ तहखाना विरूपण सामान्य, 0), भड़काऊ सेल घुसपैठ की डिग्री (0 सामान्य, तहखाना वास्तुकला - घने भड़काऊ घुसपैठ, 3), मांसपेशियों और अधिक मोटा होना (तहखाना के आधार पेशीकला mucosae, 0 पर बैठता है - चिह्नित मांसपेशियों उमड़ना वर्तमान, 3), जाम सेल रिक्तीकरण (अनुपस्थित, 0 - वर्तमान 1,) और तहखाना (विद्रधि अनुपस्थित, 0 - वर्तमान 1) 7 histological नुकसान स्कोर प्रत्येक व्यक्ति के स्कोर के योग है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि मानव यूसी के विपरीत, तहखाना फोड़े इस मॉडल की विशेषता है और नहीं कर रहे हैं शायद ही कभी देखा, सूक्ष्म ulcerations भी दुर्लभ हैं. यदि एकाधिक बृहदान्त्र वर्गों थेइसी तरह के वर्गों के बीच दाग, histological स्कोर करने के लिए प्रत्येक क्षेत्र के लिए अंतिम स्कोर (यानी बाहर का बृहदान्त्र में histological स्कोर बनाम प्रॉक्सिमल बृहदान्त्र में histological स्कोर) का निर्धारण करने के लिए किया जाना चाहिए.

4. Assays के लिए अभिकर्मकों के स्टॉक समाधान की तैयारी

  1. समाधान बी जोड़ने के समाधान के लिए (कश्मीर 2 4 HPO, DH 2 हे 1 एल में 8.7 द्विक्षारकीय पोटेशियम फॉस्फेट के छ) द्वारा पोटेशियम फॉस्फेट बफर के एक 50 मिमी समाधान तैयार (के.एच. 2 4 पीओ, 1L में 6.8 एक समाक्षारीय पोटेशियम फॉस्फेट के छ DH 2 हे) तक 6.0 की एक pH हासिल की है. शेष समाधान भविष्य के उपयोग तक फ्रिज (2-8 डिग्री सेल्सियस) में संग्रहीत किया जा सकता है है.
  2. 1 पोटेशियम फॉस्फेट बफर के एल (50 मिमी, = 6.0 पीएच) में 5 ग्राम HTAB जोड़कर hexadecyltrimethylammonium ब्रोमाइड बफर (HTAB) तैयार करें. धीरे को भंग करने और 2-8 पर दुकान करने के लिए गर्मी डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक. जब आवश्यक हो, तो फिर से भंग गर्मी.
  3. ऊतक homogenization के लिए प्रोटीन के विश्लेषण के लिए lysis बफर तैयार1M tris - हाइड्रोक्लोरिक एसिड (पीएच 8.0 =), 5M सोडियम क्लोराइड के 6 एमएल और Triton एक्स-100 निष्फल आसुत जल की 182 एमएल की 2 एमएल के 10 एमएल जोड़ने. Triton एक्स 100 बहुत कमरे के तापमान पर चिपचिपा और इस प्रकार, धीरे से पहले गरम करना चाहिए का उपयोग करने के लिए है. तैयार lysis बफर उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

5. Assays के लिए नमूना तैयार

  1. MPO विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी.
    1. -70 से नमूने निकालें ° और बर्फ पर सी जगह. 2ml Eppendorf microcentrifuge सुरक्षित लॉक ट्यूब (या किसी भी ट्यूब है कि एक homogenizer साथ इस्तेमाल किया जा सकता है) में एक तुला forcep / चिमटी से नोचना और जगह का उपयोग करके किसी भी दृश्य मल या चर्बी को हटाने के बाद प्रत्येक नमूने के वजन रिकार्ड. नमूने हर समय बर्फ पर रखा जाना चाहिए. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि इसी तरह के बृहदान्त्र टुकड़े प्रत्येक जैविक को दोहराने के (यानी बाहर का वर्गों या केवल प्रॉक्सिमल वर्गों केवल) से इस्तेमाल किया जाना चाहिए है.
    2. प्रत्येक नमूना ट्यूब homogenizer मनका जोड़ें.
    3. HTAB buf की उचित राशि जोड़ेंऊतक वजन के अनुसार fer. यदि ऊतक वजन 25 मिलीग्राम से भी कम है, 12.5mg/mL के अनुपात में बफर जोड़ने के लिए, अगर ऊतक वजन 25-50 के बीच है, 25mg/mL के अनुपात में जोड़. यदि ऊतक वजन 50 से अधिक है, 50mg/mL के अनुपात में बफर जोड़ें.
    4. 4 मिनट के लिए 30 हर्ट्ज पर एक ऊतक homogenizer के साथ homogenize. दोहराएँ अगर ऊतक पूरी तरह से homogenized नहीं है.
    5. Homogenizer मनका और 6 मिनट (13,400 XG, 4 ° C) के लिए अपकेंद्रित्र समाधान निकालें.
    6. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और जिसके परिणामस्वरूप गोली त्यागें. Supernatent ° -70 में उपयोग करें जब तक सी संग्रहीत किया जा सकता है.
  2. साइटोकाइन विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी.
    1. दोहराएँ कदम 5.1.1. 5.1.2 करने के लिए.
    2. तैयार lysis बफर के 10 एमएल protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल (पीआईसी) की 50 μl जोड़ें.
    3. तस्वीर और lysis बफर प्रत्येक वजन का चाहे नमूना समाधान के 1 एमएल जोड़ें.
    4. 30 हर्ट्ज पर 5 मिनट के लिए homogenize. दोहराएँ अगर ऊतक पूरी तरह से homogenized नहीं है.
    5. Homogenizer मनका और अपकेंद्रित्र soluti निकालें3300 x जी पर 5 मिनट के लिए पर
    6. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और जिसके परिणामस्वरूप गोली त्यागें. सतह पर तैरनेवाला ° -70 में उपयोग करें जब तक सी संग्रहीत किया जा सकता है.

6. भड़काऊ मार्करों की मात्रा का ठहराव

  1. MPO गतिविधि परख
    1. O-dianisidine dihydrochloride, DH 2 हे के 90 एमएल, और पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 10 एमएल के 16.7 मिलीग्राम के संयोजन द्वारा तैयार ओ dianisidine dihydrochloride समाधान (ओ - dianisidine) . हर परख यह समाधान के लिए ताजा तैयार करना चाहिए.
    2. 96 अच्छी तरह से थाली में तीन प्रतियों में ऊतक homogenate (5.1 अनुभाग में तैयार) के 7 μL जोड़ें.
    3. ओ - dianisidine मिश्रण पतला एच 2 2 हे (30% एच 2 2 हे DH 2 हे 96 μL में पतला के 4 μL) के 50 μL जोड़ें.
    4. O-dianisidine कुओं की प्रत्येक के लिए एच 2 2 हे युक्त मिश्रण के 200 μL जोड़ने के लिए एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए.
    5. 450 एनएम पर एक spectropho का उपयोग absorbance के उपायtometer. 30 सेकंड के अंतराल पर तीन रीडिंग ले लो.
    6. MPO गतिविधि की गणना. MPO गतिविधि / MPO मिलीग्राम ऊतक, जहां MPO की एक इकाई 1 एच 2 हे प्रति मिनट 2 कमरे के तापमान पर μmoL नीचा करने के लिए आवश्यक राशि के रूप में परिभाषित किया गया है इकाइयों (यू) में मापा जाता है. यह देखते हुए कि MPO की एक इकाई (यू) = 1 एच 2 हे 2 विभाजन के μmoL और है कि एच 2 हे 2 1 μmoL 1.13 x 10 एनएम -2 / मिनट के absorbance के बदलाव देता है, MPO के प्रत्येक नमूने में इकाइयों निर्धारित किया जाता है absorbance में परिवर्तन के रूप में [ΔA (2 टी टी 1)] / Δmin x (-2 x 10 1.13 ). ऊतक के मिलीग्राम प्रति यूनिट प्राप्त करने के लिए, ऊतक का उपयोग करें: बफर अनुपात. उदाहरण के लिए, यदि एक ऊतक: 50 मिलीग्राम / एमएल के बफर अनुपात में इस्तेमाल किया गया था, homogenate के 7 μL में, वहाँ ऊतक के 0.35 मिलीग्राम है. इसलिए, मिलीग्राम प्रति इकाइयों ऊतक प्राप्त करने के लिए, 0.35 से MPO की इकाइयों विभाजित है. नीचे एक नमूना absorbance के मूल्यों का उपयोग गणना (एनएम) शामिल है (संभालने कि नमूना तीन प्रतियों में जोड़ा गया है):
नमूना टाइम 0 सेकंड समय 30 सेकंड समय 60 सेकंड
एक 1 2 3 1 ' 2 ' 3 ' 1 " 2'' 3 "
0.048 0.048 0.051 0.061 0.061 0.065 0.074 0.073 0.078
  1. औसत 0 सेकंड समय में = (0.048 + 0.048 + 0.051) / 3 = 0.049 एनएम
  2. औसत समय 30 सेकंड में = .0623 एनएम
  3. समय 60 सेकंड में औसत = 0.075 एनएम
  4. Absorbance (ΔA) में 0 से 30 / सेक मिलीग्राम ऊतक (50 मिलीग्राम / ऊतक के एमएल संभालने: बफर अनुपात) परिवर्तित करने के लिए = [(.0623-0.049) / (10 -2 एक्स 1.13)] / 0.35 = 3.363
  5. अवशोषित में बदलेंमंजूरी (ΔA) 30 से 60 / सेक मिलीग्राम ऊतक = 3.211
  6. * MPO गतिविधि (यू / मिलीग्राम ऊतक) = ΔA की औसत (00-30) और (30-60) = ΔA 3.287
  1. समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की एलिसा द्वारा मात्रा का ठहराव
    1. Cytokine स्तर (आईएल 1β, आईएल -6 और TNF-α) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) किट (, सिस्टम अनुसंधान एवं विकास Quantikine murine) का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं.
    2. प्रत्येक एलिसा से absorbance मूल्यों ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख प्रत्येक नमूने के लिए संबंधित का उपयोग सामान्यीकृत है और मिलीग्राम / प्रोटीन की स्नातकोत्तर की इकाइयों में व्यक्त किया.

7. प्रतिनिधि परिणाम

उपयुक्त DSS आहार का प्रशासन चूहों में तीव्र बृहदांत्रशोथ प्रेरित करेगा. इस के बारे उपचार की अवधि के दौरान, दाई का आकलन करने के लिए और रोग के नैदानिक ​​प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. DSS के साथ इलाज पशु अपने प्रारंभिक वजन की तुलना में महत्वपूर्ण वजन घटाने, ढीला मल और fecal दिखाएगा(चित्रा 1) खून बह रहा है. बलिदान और बृहदान्त्र की परीक्षा पर, बृहदांत्रशोथ की गंभीरता macroscopically बृहदान्त्र लंबाई, colonic खून बह रहा है, मल खून बह रहा है, मल की निरंतरता का ढीला छोटा के आधार पर बने है, और गुदा रक्तस्राव के लक्षण नियंत्रण केवल पानी के साथ इलाज की तुलना में (चित्रा 2 टेबल और ) 1. Colonic ऊतकों एच एंड ई के साथ दाग नमूनों की क्रॉस वर्गों बनाम पानी का इलाज नियंत्रण DSS इलाज कोलन (चित्रा 3) के लिए उच्च histological स्कोर होगा. आगे DSS इलाज चूहों में सूजन की हद तक विशेषताएँ MPO गतिविधि homogenized colonic ऊतकों के नमूनों से मूल्यांकन किया जा सकता है. DSS-इलाज कोलन अधिक नियंत्रण (चित्रा 4) की तुलना में MPO गतिविधि होगा. इसके अलावा, यह समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के स्तर में वृद्धि (आईएल 1β, आईएल -6, TNF-α) (चित्रा 5) के साथ जुड़ा हुआ है.

चित्रा 1.
चित्रा 1 पुरुष, C57BL 6 / चूहों 5 दिनों के लिए पीने के पानी में 5% DSS दिया गया. दाई स्कोर दैनिक प्रत्येक जानवर के लिए मूल्यांकन किया गया और प्रत्येक समूह के लिए प्रति दिन औसतन (± SEM n = 4 चूहों / समूह मतलब).

चित्रा 2.
चित्रा 2. C57BL 6 / चूहों 5 दिनों के लिए पीने के पानी में 5% DSS दिया गया. नियंत्रण चूहों DSS बिना पानी प्राप्त किया. Macroscopic क्षति / स्कोर रोग की गंभीरता स्कोर आँख बंद करके दिन 5 पोस्ट DSS प्रेरित बृहदांत्रशोथ पर मूल्यांकन किया गया. चूहों कि इस के बारे प्राप्त से अलग colons उच्च macroscopic नुकसान स्कोर (मलाशय खून बह रहा है, गुदा आगे को बढ़ाव, दस्त, colonic खून बह रहा है) अधिक से अधिक रोग की गंभीरता (± SEM n = 4 चूहों / समूह मतलब) का संकेत है.

चित्रा 3
चित्रा 3. C57BL 6 / चूहों को पीने के पानी में 5% समाधान DSS दिए गए क्रम में बृहदांत्रशोथ प्रेरित . चूहों पर नियंत्रण DSS बिना पानी प्राप्त है. (ए) histological स्कोर आँख बंद करके एच एंड ई दाग colonic ऊतकों दिन 5 के बाद DSS प्रशासन पर एकत्र वर्गों का उपयोग रन बनाए थे. (बी) DSS इलाज के नमूने अधिक histological (सी) नियंत्रण (± SEM n = 4 चूहों / समूह मतलब) की तुलना में नुकसान (अधिक सेलुलर घुसपैठ, अधिक जाम सेल रिक्तीकरण, अधिक से अधिक विरूपण / तहखाना वास्तुकला के लिए क्षति) दिखाते हैं. (बी) और (सी), तारांकन (*) जाम सेल रिक्तीकरण और तहखाना वास्तुकला के विरूपण के क्षेत्र को इंगित करता है, संख्या चिह्न (#) सेलुलर घुसपैठ इंगित करता है.

चित्रा 4.
4. सभी चूहों दिन 5 DSS और colonic ऊतकों के नमूनों की पोस्ट प्रशासन पर बलिदान थे चित्रा MPO गतिविधि का आकलन करने के लिए एकत्र किए गए थे. DSS प्रेरित बृहदांत्रशोथ की गंभीरता MPO गतिविधि का उच्च स्तर के साथ नियंत्रण (मतलब ± SEM, n = 4 चूहों समूह /) की तुलना में जुड़ा हुआ है.

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5 और उच्च MPO स्तर, DSS प्रेरित बृहदांत्रशोथ के गंभीरता के अलावा चित्रा. आईएल 1β, आईएल -6, TNF-α जैसे समर्थक सूजन साइटोकिन्स का एक बढ़ा स्तर (± SEM n = 4 चूहों मतलब है के साथ जुड़ा हुआ है /) समूह.

1 टेबल macroscopic / रोग गंभीरता स्कोर.

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Discussion

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DSS बृहदांत्रशोथ आंतों की सूजन का एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया रासायनिक प्रेरित मॉडल है. इस मॉडल में, चूहों पीने के पानी DSS, जो विषाक्त हो सकता है सोचा है उपकला कोशिकाओं आंत और mucosal बाधा की अखंडता को बाधित के साथ पूरक दी जाती है DSS के 10 प्रशासन है कि ढीली मल, मल से खून बह रहा द्वारा विशेषता है एक तीव्र बृहदांत्रशोथ लाती है. और granulocytes के साथ DSS प्रशासन के दौरान घुसपैठ 10., बृहदांत्रशोथ आमतौर पर महत्वपूर्ण वजन घटाने और मल में रक्त की उपस्थिति है, जो एक fecal मनोगत रक्त परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है है के साथ जुड़ा हुआ है 5.10,11 colonic ऊतकों के नमूनों इकट्ठा करने के बाद, बृहदांत्रशोथ गंभीरता किया जा सकता है. बृहदान्त्र के macroscopic परीक्षा और एच एंड ई के histological विश्लेषण दाग colonic वर्गों पार पहले से स्थापित स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग कर के द्वारा विशेषता 9 .

जब इस प्रोटोकॉल का पालन, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि बृहदांत्रशोथ की गंभीरता से प्रेरितDSS प्रजातियों है और विशिष्ट तनाव के अलावा 12 अलग जानवर सुविधाओं और आवास के कमरे के बीच आंतों microflora में मतभेद DSS प्रशासन के परिणाम बदल सकता है. 13,14 इस प्रकार, प्रारंभिक अध्ययन का उपयोग कर इस के बारे खुराक और की अवधि का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है इस के बारे उपचार. इन चर का अनुकूलन करने में विफलता मृत्यु या कोई बृहदांत्रशोथ करने के लिए थोड़ा के एक उच्च घटना में परिणाम सकता है. एक बार अनुकूलित किया है, इस मॉडल बृहदांत्रशोथ के मृत्यु दर का एक कम दर के साथ एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है निर्दिष्ट आणविक वजन के DSS उपयोग (अभिकर्मकों की तालिका देखें). DSS नमक अभिकर्मक के अन्य रूपों बृहदांत्रशोथ उपज नहीं है या मौत के उच्च घटना के लिए नेतृत्व कर सकते हो सकता है.

गंभीर macroscopic और histological क्षति है, जो वृद्धि हुई MPO के रूप में अच्छी तरह के रूप में गतिविधि समर्थक भड़काऊ cytokine उत्पादन के उच्च स्तर के साथ जुड़ा हुआ है में इस मॉडल के परिणाम का उपयोग बृहदांत्रशोथ की प्रेरण. लिम्फोसाइटों जैसे Agranulocytes, एकघ monocytes, समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के महत्वपूर्ण स्रोत हैं, जबकि MPO एक एंजाइम neutrophils (और एक हद तक कम monocytes और मैक्रोफेज) जैसे granulocytes भीतर निहित है. इस प्रोटोकॉल भी colonic ऊतक dinitrobenzene सल्फोनिक एसिड (गैर - बैंकिंग पर्यवेक्षण विभाग) के साथ इलाज के नमूनों में MPO गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है - प्रेरित बृहदांत्रशोथ 15 गैर - बैंकिंग पर्यवेक्षण विभाग प्रेरित बृहदांत्रशोथ है एक अच्छी तरह से विशेषता बृहदान्त्र की टी सेल की मध्यस्थता transmural सूजन है कि intrarectal टपकाना द्वारा प्रशासित है. इथेनॉल में गैर - बैंकिंग पर्यवेक्षण विभाग पदार्थ के 16 इथेनॉल नीचे mucosal बाधा को तोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है, की अनुमति के लिए गैर - बैंकिंग पर्यवेक्षण विभाग ऑटोलॉगस या microbiota hapten संशोधित आत्म प्रतिजनों के लिए एक मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्तेजक प्रोटीन haptenize इस मॉडल की 16 एक लाभ से अधिक है.. इस के बारे प्रेरित मॉडल है कि eliciting एजेंट जाना जाता है. व्यवस्था है जिसके द्वारा DSS बृहदांत्रशोथ शुरू, तथापि, के लिए निर्धारित किया जा रहता है. दिलचस्प है, अध्ययन से पता चला है कि DSS प्रशासन कोलाई का कारण बनता हैप्राकृतिक हत्यारा सेल की कमी, और टी और बी सेल चूहों की कमी में आज़ादी के अध्ययन के लिए सुझाव है कि इन कोशिकाओं (अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ जुड़े) बृहदांत्रशोथ के प्रेरण में महत्वपूर्ण हो सकता है और इस प्रकार, इस मॉडल के लिए उपयुक्त हो सकता है हो सकता है सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के बृहदांत्रशोथ की पीढ़ी में भूमिका 4,17.

MPO गतिविधि का सबसे सटीक उपाय के लिए, हमने पाया है कि जो बृहदांत्रशोथ मॉडल प्रयोग किया जाता है की परवाह किए बिना, MPO स्तर ऊतक संग्रह के पहले हफ्ते के भीतर निर्धारित किया जाना चाहिए MPO गतिविधि के रूप में समय के साथ कम जाता है. MPO गतिविधि सूजन के एक किराए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, ऊतक साइटोकिन्स और histological स्कोरिंग की मात्रा का ठहराव बृहदांत्रशोथ के दौरान भड़काऊ प्रतिक्रिया की पूरी मूल्यांकन की सुविधा अभिन्न अंग हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा के से अनुदान (CIHR) और Crohn है और बृहदांत्रशोथ फाउंडेशन (CCFC) के कनाडा के द्वारा समर्थित है.

Materials

स्कोर गुदा से खून बह रहा गुदा आगे को बढ़ाव स्टूल संगति रक्त
0 कोई नहीं कोई नहीं साधारण साधारण
1 लाल आगे को बढ़ाव के लक्षण नरम लाल
2 डार्क रेड साफ आगे को बढ़ाव सुकुमार गहरे लाल
3 सकल रक्तस्राव व्यापक आगे को बढ़ाव दस्त काला
Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL) Eppendorf 0030 120.094
Biotek EL808 Absorbance plate reader BioTek EL808
Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da) MP Biomedicals 160110
Gen5 (software) BioTek Version 1.10.8
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G
Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water Sigma-Aldrich 216763 Store at 2-8°C
Microtest plate 96-well flat bottom Sarstedt Ltd 82.1581 For single use only
o-Dianisidine Sigma-Aldrich D-3252 Light sensitive. Store at 2-8°C
Potassium phosphate, dibasic Caledon 6620-1
Potassium phosphate, monobasic EMD Millipore PX1565-1
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Store at -20°C
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II Qiagen 69997

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References

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IBD के DSS प्रेरित मॉडल में आंत्र शोथ जांच
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Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).More

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).

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