Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Gransker Intestinal Betennelse i DSS-indusert Modell av IBD

doi: 10.3791/3678 Published: February 1, 2012

Summary

Eksperimentelle modeller av inflammatorisk tarmsykdom har tillatt oss å undersøke det komplekse medfødte og adaptive immunresponser assosiert med patogenesen. Ved hjelp av histologiske scoring, kvantifisering av proinflammatoriske cytokiner og myeloperoxidase aktivitet, kan man begynne å vurdere disse svarene sett i inflammatorisk tarmsykdom.

Abstract

Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) omfatter et utvalg av intestinal patologi, den vanligste av disse er ulcerøs kolitt (UC) og Crohns sykdom (CD). Både UC og CD, når den er tilstede i tykktarmen, generere et lignende symptom profil som kan inkludere diaré, endetarms blødning, magesmerter og vekttap. 1 Selv om patogenesen av IBD er fortsatt ukjent, er det beskrevet som en multifaktoriell sykdom som innebærer både genetiske og miljømessige komponenter. 2

Det finnes mange og variable dyremodeller av colonic betennelse som ligner flere funksjoner av IBD. Dyremodeller av kolitt spenner fra dem som oppstår spontant hos følsomme stammer av enkelte arter til de som krever tilførsel av bestemte konsentrasjoner av kolitt-induserende kjemikalier, for eksempel dekstransulfat sodium (DSS). Kjemisk-indusert modeller av gut betennelse er de mest brukte og best beskrives modeller av IBD. AdminiStatens vegvesen av DSS i drikkevann produserer akutt eller kronisk kolitt, avhengig av administrasjonen protokollen. 3 Dyr gitt DSS utstilling vekttap og tegn på løs avføring eller diaré, noen ganger med bevis på endetarms blødning. 4,5 Her beskriver vi de metoder som kolitt utvikling og den resulterende inflammatoriske responsen kan karakteriseres etter administrasjon av DSS. Disse metodene inkluderer Histologisk analyse av hematoxylin / eosin fargede colon seksjoner, måling av proinflammatoriske cytokiner, og bestemmelse av myeloperoxidase (MPO) aktivitet, som kan brukes som et surrogat markør for betennelse. 6

Omfanget av den inflammatoriske responsen i sykdom tilstand kan vurderes ved tilstedeværelse av kliniske symptomer eller ved endring i histologi i mucosal vev. Colonic histologiske skaden blir vurdert ved hjelp av en scoring system som vurderer tap av krypten arkitektur, inflammatorisk celle infiltrasjon, muskel thickening, beger celle uttømming, og krypten abscess. syv kvantitativt, kan nivået av proinflammatoriske cytokiner med akutte inflammatoriske egenskaper, for eksempel interleukin (IL)-1β, IL-6 og tumor nekrose faktor (TNF)-α, kan bestemmes ved hjelp konvensjonelle ELISA metoder. I tillegg kan MPO aktiviteten måles ved hjelp av en kolorimetrisk analyse og brukes som en indeks på betennelse. 8

I eksperimentell kolitt, er sykdommens alvorlighetsgrad ofte korrelert med en økning i MPO aktivitet og høyere nivåer av proinflammatoriske cytokiner. Kolitt alvorlighetsgrad og betennelse-assosiert skade kan vurderes ved å undersøke avføring konsistens og blødning, i tillegg til å vurdere histopatologiske tilstand av tarmen med hematoxylin / eosin fargede colonic vev seksjoner. Colonic vev fragmenter kan brukes til å bestemme MPO aktivitet og cytokin produksjon. Til sammen kan disse tiltakene brukes til å evaluere intestinal betennelsesreaksjon idyremodeller av eksperimentell kolitt.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Murine modell av DSS-indusert akutt kolitt

  1. Legg dekstransulfat sodium (DSS) til autoklaveres drikkevann til ønsket endelig konsentrasjon (1-5%) (wt / vol) (dvs. å gjøre en 5% DSS løsning, legge til 25 mg DSS pulver til 500 ml autoklaveres vann) . Stock løsningen kan stå i romtemperatur i opptil én uke eller ved 4 ° C inntil bruk.
  2. I en biosikkerhet hette, hell lager DSS løsning i 50 ml Falcon rør (en nødvendig per bur). Hold stamløsning å fylle rørene når det trengs.
  3. Erstatt drikkevannet i hver mus bur med DSS løsning (i 50 ml Falcon rør) (Varigheten vil avhenge av DSS regime som er brukt. For eksempel bruker 6-8 uker gammel mannlig C57BL / 6 mus, forvalter vi en 5% DSS løsning for totalt fem dager). Mus bør ikke ha tilgang til noen annen vannkilde. Kontroll mus er gitt autoklaveres drikkevann uten DSS.
  4. Vei mus daglig og registrere mengden av DSS konsumert per dag. Topp hverflaske til 50 ml etter innspilling DSS nivåer. Dette er å måle den omtrentlige volumet av DSS konsumert per merd per mus under hele forsøket. I våre studier, bruker vi en 5% DSS løsning for 5 dager med mannlige C57BL / 6 mus. Betydelig vekttap, endret avføring konsistens og tegn på fekal blod blir sett på så tidlig som dag 3 ved hjelp av denne spesielle DSS regime. Under DSS administrasjonen, mus viser uttalt vekttap (rundt 5-10% av sin opprinnelige vekt på dag 5) med vekttap større enn 20% av opprinnelig vekt med dehydrering og diaré å være den store fysiologiske indikator på at et dyr er på eller nær endepunkt. Dersom dyret er gitt tilgang til vanlig vann etter 5 dager på 5% DSS, vil den komme i løpet av 7 dager. Alle forsøk skal godkjennes av institusjonens dyreetikk komité og være i samsvar med godkjent Animal Utnyttelse Protocol (AUP).
  5. Under varigheten av eksperimentet, en sykdom aktivitet indeks (DAI)poengsum kan vurderes å vurdere den kliniske utviklingen av kolitt. DAI er den kombinerte score på vekttap i forhold til opprinnelige vekt, avføring konsistens, og blødning. Poeng er definert som følger: vekttap: 0 (ingen tap), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%) og 4 (> 20%), avføring konsistens: 0 (normal), 2 (løs avføring), og 4 (diaré) og blødninger: 0 (ingen blod), 1 (Hemoccult positive), 2 (Hemoccult positive og visuell pellet blødning) og 4 (brutto blødning, blod rundt anus). DAI kan scores daglig i varigheten av DSS behandlingen.
  6. På tidspunktet for valg, veie og ofre mus. Mus kan avlives ved cervikal forskyvning etter inhalasjon av isofluran eller ved annen metode godkjent av institusjonens dyret anlegg.

2. Samle colonic vevsprøver

  1. Avdekk ventrale siden av dyret og våte underliv området med en 70% etanol løsning. På dette punktet, se Tabell 1 og gjøre oppmerksom på enNY tegn på rektal blødning (blod til stede ved anal åpningen) eller rektal prolaps i hvert dyr.
  2. Bruk standard dissecting saks til Innsnittsduk buken ved å lage et ventrale midtlinje snitt.
  3. Finn tykktarm og transekt tykktarmen så nær colorectal margin som mulig for å frigjøre den distale colon.
  4. Forsiktig og sakte trekk ut hele tykktarmen, løsne det fra de omkringliggende mesenteriet.
  5. Transekt kolon ved colonocecal margin å frigjøre den proksimale enden av tykktarmen. Avføringen kan fjernes ved å skylle colon med sterile PBS ved hjelp av en sonde nål festet til en 3 eller 5 ml sprøyte eller ved å forsiktig klemme den ut ved hjelp av et par bøyd pinsett / tang. Bruke hele tykktarmen, vurdere for skader (se avsnitt 3.1)
  6. Tissue prøvetaking for histologiske analyser og andre analyser kan gjøres ved å kutte 0,5 cm til 1,0 cm lang colonic fragmenter gjør oppmerksom på hvilket område prøven er fra (dvs. proksimale, midtre eller distale).
  7. Vevsprøverskal brukes til analyser kan enkeltvis plasseres i 1,5 ml Eppendorf rør og frosset i flytende nitrogen og lagret til bruk ved -70 ° C.

3. Vurdering av kolitt alvorlighetsgrad

  1. Makroskopiske eller sykdommens alvorlighetsgrad poengsum vurderes terminalt av en upartisk observatør ved hjelp av en tidligere utgitt scoring system (Tabell 1). Ni Krakk konsistens kan vurderes ved hjelp av en pinsett og trykke ned på avføringen for å bestemme konsistens. Å bestemme en score for blod i avføringen, noterer fargen på avføringen (dvs. svart avføring versus lys brun avføring) og ytterligere validere ved hjelp av en Hemoccult test. Ved hjelp av scoring system, fastsette en poengsum for hvert av forholdene. Den endelige makroskopiske poengsum for hvert dyr er summen av hver enkelt score.
  2. Å evaluere histologiske skade av kolitt alvorlighetsgrad, kuttet et lite fragment (0,5 cm) av tykktarmen, oppbevar i en vev kassett og senk i bufret 10% formalin løsning. Forbered 5mikrometer parafin embedded tverrsnitt og beis seksjoner med hematoxylin / eoxin (H & E) ved hjelp av egnede prosedyrer. Colon fragmenter kan tas fra den proksimale, mid-kolon, eller distale delen av tykktarmen.
  3. H & E beiset colonic vev seksjoner blir bedømt ved en blindet observatør ved hjelp av en tidligere utgitt system for følgende tiltak: krypten arkitektur (normal, 0 - alvorlig krypten forvrengning med tap av hele krypter, 3), grad av inflammatorisk celle infiltrasjon (normal, 0 - tett inflammatorisk infiltrere, 3), muskel fortykkelse (base i krypten sitter på muskularis slimhinner, 0 - markerte muskler jevning til stede, 3), beger celle utarming (fraværende, 0 - stede, 1) og krypten abscess (fraværende, 0 - til stede , 1). 7. histologiske skaden poengsum er summen av hver enkelt score. Det bør bemerkes at i motsetning til human UC, krypten abscesser er ikke karakteristisk for denne modellen, og er sjelden sett; mikroskopiske sår er også sjeldne. Hvis flere kolon seksjoner varbeiset, histologiske skårer mellom liknende seksjoner bør brukes til å bestemme den endelige poengsummen for hvert område (dvs. histologiske score i proksimale colon versus histologiske score i distal kolon).

Fire. Forbered lager løsninger av reagenser for analyser

  1. Tilbered en 50 mM løsning av kaliumfosfat buffer ved å legge til løsning B (K 2 4 HPO, 8,7 g dibasic kaliumfosfat i 1 L av dH 2 O) til løsning A (KH 2 4 PO, 6,8 g monobasic kaliumfosfat i 1L av dH 2 O) til en pH på 6,0 er oppnådd. Gjenværende løsninger kan oppbevares i kjøleskap (2-8 ° C) til fremtidig bruk.
  2. Forbered hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) buffer ved å legge 5 g HTAB inn 1 L av Potassium Phosphate buffer (50 mM, pH = 6.0). Forsiktig varme for å løse opp og lagre ved 2-8 ° C før bruk. Ved behov, varme å re-oppløse.
  3. Forbered lysis buffer for vev homogenisering for protein analyse avtilsette 10 mL 1M tris-saltsyre (pH = 8,0), 6 ml 5M natriumklorid og 2 mL av Triton X-100-182 ml sterilisert destillert vann. Triton X-100 er veldig viskøs ved romtemperatur, og dermed bør forsiktig varmes før bruk. Den forberedt lysis buffer kan oppbevares ved -20 ° C til bruk.

5. Prøveopparbeidelse for analyser

  1. Prøveopparbeidelse for MPO analyse.
    1. Ta prøver fra -70 ° C og legg på is. Record vekten av hver prøve etter fjerning noen synlig avføring eller fett ved hjelp av en bøyd forcep / pinsett og legg inn en 2ml Eppendorf Safe-Lock mikrosentrifuge tube (eller rør som kan brukes med en homogenizer). Prøvene bør holdes på is hele tiden. Det er viktig å merke seg at lignende colon fragmenter skal brukes fra hver biologisk replikere (dvs. distal seksjoner eneste eller proksimale deler bare).
    2. Legg homogenizer perle til hvert prøverør.
    3. Tilsett passende mengde HTAB buffer ifølge vev vekt. Hvis vevet i vekt er mindre enn 25 mg, legger buffer i forholdet 12.5mg/mL, hvis vevet vekten er mellom 25-50, legg i forholdet 25mg/mL. Hvis vevet i vekt er større enn 50, legger buffer i forholdet 50mg/mL.
    4. Homogenisere med en vev homogenizer for 4 min ved 30 Hz. Gjenta om vev ikke er fullt homogenisert.
    5. Fjern homogenizer perle og sentrifuger løsning for 6 min (13 400 xg, 4 ° C).
    6. Samle supernatanten og kast den resulterende pellet. Supernatent kan oppbevares ved -70 ° C til bruk.
  2. Prøveopparbeidelse for cytokin analyse.
    1. Gjenta trinn 5.1.1. til 5.1.2.
    2. Tilsett 50 mL av protease inhibitor cocktail (PIC) til 10 mL preparerte lysis buffer.
    3. Tilsett 1 mL av PIC og lysis buffer løsning til hver prøve uavhengig av vekt.
    4. Homogenisere for 5 min ved 30 Hz. Gjenta om vev ikke er fullt homogenisert.
    5. Fjern homogenizer perle og sentrifuger solutipå i 5 min på 3300 x g.
    6. Samle supernatanten og kast den resulterende pellet. Supernatant kan oppbevares ved -70 ° C til bruk.

Seks. Kvantifisering av inflammatoriske markører

  1. MPO aktivitet assay
    1. Forbered o-dianisidine dihydrochloride (o-dianisidine) løsning ved å kombinere 16,7 mg av o-dianisidine dihydrochloride, 90 ml dH 2 O, og 10 mL av kalium fosfat buffer. Denne løsningen bør være forberedt friskt for hver analysen.
    2. Legg til 7 mL av vev homogenate (utarbeidet i pkt. 5.1) i tre eksemplarer til en 96-brønn plate.
    3. Tilsett 50 mL fortynnet H 2 O 2 (4 mL av 30% H 2 O 2 fortynnes i 96 mL av dH 2 O) til o-dianisidine blanding.
    4. Bruk en flerkanals pipetten til å legge 200 mL av o-dianisidine blanding som inneholder H 2 O 2 til hver av brønnene.
    5. Mål absorbansen ved 450 nm ved hjelp av en spectrophotometer. Ta tre avlesninger med 30 sekunders intervaller.
    6. Beregn MPO aktivitet. MPO aktivitet er målt i enheter (U) av MPO / mg vev, der én enhet av MPO er definert som det beløpet som trengs for å degradere en mikromol av H 2 O 2 per minutt ved romtemperatur. Tatt i betraktning at en enhet (U) av MPO = 1 mikromol av H 2 O 2 splittet og at 1 mikromol av H 2 O 2 gir en endring i absorbans på 1,13 x 10 -2 nm / min, er enheter av MPO i hver prøve bestemmes som endring i absorbans [ΔA (t 2-t 1)] / Δmin x (1,13 x 10 -2). For å få enheter per mg vev, bruke vev: buffer ratio. For eksempel, hvis en vev: buffer på 50 mg / ml ble brukt, i 7 mL av homogenate, det er 0,35 mg vev. Derfor, for å få enheter per mg vev, dele enheter av MPO ved 0.35. Et eksempel beregning med absorbans verdier (nm) er inkludert nedenfor (forutsatt at prøven er lagt i tre eksemplarer):
Sample Tid 0 sek Tid 30 sek Tid 60 sek
A 1 2 3 1 ' 2 ' 3 ' 1 " 2'' 3 "
0.048 0.048 0.051 0.061 0.061 0.065 0.074 0.073 0.078
  1. Gjennomsnittlig ved tid 0 sek = (0,048 + 0,048 + 0,051) / 3 = 0,049 nm
  2. Gjennomsnittlig ved 30 Tid sek = 0,0623 nm
  3. Gjennomsnittlig på Time 60 sek = 0,075 nm
  4. Endring i absorbans (ΔA) fra 0 til 30 sek / mg vev (forutsatt 50 mg / ml av vev: buffer ratio) = [(0,0623 til 0,049) / (1,13 x 10 -2)] / 0,35 = 3.363
  5. Endring i absorbereance (ΔA) 30-60 sek / mg vev = 3.211
  6. * MPO aktivitet (U / mg vev) = gjennomsnittlig ΔA (0-30) og ΔA (30-60) = 3.287
  1. Kvantifisering av proinflammatoriske cytokiner ved ELISA
    1. Cytokin (IL-1β, IL-6 og TNF-α) nivåer er bestemmes ved hjelp av kommersielt tilgjengelige enzyme-linked immunsorbent analyse (ELISA) kit (Quantikine murine; R & D Systems).
    2. Absorbans verdier fra hver ELISA er normalisert ved hjelp av en Bradford protein assay respektive til hver prøve og uttrykkes i enheter av pg / mg protein.

7. Representant Resultater

Administrasjon av den aktuelle DSS diett vil indusere akutt kolitt i mus. Under varigheten av DSS behandling, kan DAI brukes til å vurdere og evaluere klinisk progresjon av sykdommen. Dyr behandlet med DSS vil vise betydelig vekttap i forhold til sine opprinnelige vekter, løs avføring og fekalblødning (Figur 1). Ved offer og undersøkelse av tykktarmen, er alvorlighetsgraden av kolitt makro scoret basert på forkortelse av colon lengde, colonic blødning, fecal blødning, løsning av avføring konsistens, og tegn på rektal blødning sammenlignet med kontroller behandlet med bare vann (Figur 2 og Tabell 1). Tverrsnitt av colonic vevsprøver farget med H & E vil ha høyere histologiske score for DSS-behandlet kolon versus vann-behandlet kontroller (figur 3). For ytterligere å karakterisere omfanget av betennelse i DSS-behandlede mus, kan MPO aktiviteten vurderes fra homogenisert colonic vevsprøver. DSS-behandlet kolon vil ha høyere MPO aktivitet sammenlignet med kontroller (figur 4). I tillegg er dette assosiert med økte nivåer av proinflammatoriske cytokiner (IL-1β, IL-6, TNF-α) (figur 5).

Figur 1.
Figur 1. Male ble C57BL / 6 mus som fikk 5% DSS i drikkevann i 5 dager. DAI score ble vurdert daglig for hvert dyr, og var i gjennomsnitt per dag for hver gruppe (gjennomsnitt ± SEM, n = 4 mus / gruppe).

Figur 2.
Figur 2. C57BL / 6 mus ble gitt 5% DSS i drikkevann i 5 dager. Kontroll mus fikk vann uten DSS. Makroskopiske skader poengsum / sykdommens alvorlighetsgrad scorene var blindt vurdert på dag 5 etter DSS-indusert kolitt. Kolon isolert fra mus som fikk DSS har høyere makroskopiske skader score (rektal blødning, rektal prolaps, diaré, colonic blødning) indikerer større sykdommens alvorlighetsgrad (gjennomsnitt ± SEM, n = 4 mus / gruppe).

Figur 3
Figur 3. C57BL / 6 mus ble gitt 5% DSS løsning i drikkevann for å indusere kolitt. Kontroll mus fikk vann uten DSS. (A) Histologiske scorene var blindt rangert med H & E beiset colonic vev seksjoner samlet på dag 5 etter DSS administrasjon. (B) DSS-behandlede prøvene viser flere histologiske skade (mer cellulær infiltrasjon, flere beger celle utarming, større forvrengning / skade krypten arkitektur) sammenlignet med (C) kontroller (mean ± SEM, n = 4 mus / gruppe). I (B) og (C), indikerer asterisk (*) område av pokal celle uttømming og forvrengning av krypten arkitektur, antall tegn (#) indikerer cellulær infiltrasjon.

Figur 4.
Figur 4. Alle musene ble ofret på dag 5 etter administrasjon av DSS og colonic vevsprøver ble samlet for å vurdere MPO aktivitet. Alvorlighetsgrad av DSS indusert kolitt er assosiert med høyere nivåer av MPO aktivitet sammenlignet med kontroller (gjennomsnitt ± SEM, n = 4 mus / gruppe).

_upload/3678/3678fig5.jpg "/>
Figur 5. I tillegg til høyere MPO nivåer, alvorlighetsgraden av DSS-indusert kolitt er også assosiert med økt nivå av pro-betennelse cytokiner som IL-1β, IL-6, TNF-α (gjennomsnitt ± SEM, n = 4 mus / gruppe).

Tabell 1. Makroskopisk / Disease Severity Score

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DSS kolitt er en mye brukt kjemisk indusert modell av intestinal inflammasjon. I denne modellen er mus som fikk drikkevann supplert med DSS, som antas å være giftig for gut epitelceller og forstyrre integriteten til mucosal barriere. 10 Administrasjon av DSS induserer en akutt kolitt som er preget av løs avføring, fecal blødning, og infiltrasjon med granulocytter. 10 Under DSS administrasjon er kolitt vanligvis forbundet med betydelig vekttap og tilstedeværelse av blod i avføringen, noe som kan bli vurdert av en fekal okkult blod test. 5.10,11 Etter samle colonic vevsprøver, kan kolitt alvorlighetsgrad være karakterisert ved makroskopisk undersøkelse av tykktarmen og histologiske analyser av H & E beiset colonic tverrsnitt med tidligere etablert scoring systemer. 9

Når du følger denne protokollen, er det viktig å merke seg at alvorlighetsgraden av kolitt indusert avDSS er arter og belastning spesifikke. 12. I tillegg kan forskjeller i tarmens mikroflora mellom ulike dyr fasiliteter og bolig rommene endre utfallet av DSS administrasjon. 13,14 Dermed kan innledende studier med DSS være nødvendig for å optimalisere dosering og varighet av DSS behandling. Unnlatelse av å optimalisere disse variablene kan resultere i en høy forekomst av død eller liten eller ingen kolitt. Når optimalisert, kan denne modellen brukes som en meget reproduserbar modell av kolitt med lav dødelighet. I tillegg er det viktig å bruke DSS av den angitte molekylvekt (Se tabell av reagenser). Andre former for DSS salt reagens kan ikke produsere kolitt eller kan føre til høy forekomst av død.

Induksjon av kolitt bruke denne modellen resulterer i alvorlige makroskopiske og histologiske skade, som er assosiert med økt MPO aktivitet samt høyere nivåer av proinflammatoriske cytokin produksjon. Agranulocytes, slik som lymfocytter end monocytter, er viktige kilder av proinflammatoriske cytokiner, mens MPO er et enzym som finnes i granulocytter som nøytrofile (og i mindre grad monocytter og makrofager). Denne protokollen kan også brukes til å måle MPO aktivitet i colonic vevsprøver behandlet med dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS) -. Indusert kolitt 15 DNBS-indusert kolitt er en godt karakterisert T-celle mediert transmuralt betennelse i tykktarmen som er administrert av intrarectal instillasjon av DNBS stoffet i etanol. 16 Etanol brukes til å bryte ned mucosal barriere, noe som åpner for DNBS å haptenize til autologe eller microbiota proteiner stimulere vertens immunrespons på hapten-modifiserte selv-antigener. 16 En fordel med denne modellen over av DSS-indusert modellen er at den utløsende agenten er kjent. Den mekanismen som DSS initierer kolitt, derimot, gjenstår å fastslå. Interessant, har studier vist at DSS administrasjon forårsaker colitis i natural killer cell-mangelfull, og T-og B-celle mangelfull mus, noe som tilsier at disse cellene (assosiert med den adaptive immunsystemet) kan ikke være kritisk i induksjon av kolitt og dermed kan denne modellen være egnet for å studere rolle det medfødte immunsystemet i generering av kolitt. 4,17

For de mest nøyaktige mål på MPO aktivitet, har vi funnet ut at uansett hvilken kolitt modell er brukt, bør MPO nivåer bestemmes i løpet av den første uken av vev samling som MPO aktivitet har en tendens til å avta over tid. MPO aktivitet kan brukes som et surrogat markør for betennelse. Men kvantifisering av vev cytokiner og histologiske scoring er integrert for å lette den fullstendige vurderingen av den inflammatoriske responsen under kolitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra Canadian Institutes of Health Research (CIHR) og ved Crohns og kolitt Foundation of Canada (CCFC).

Materials

Resultat Rektal blødning Rektal Prolaps Krakk Konsistens Blood
0 Ingen Ingen Normal Normal
1 Red Tegn på prolaps Soft Red
2 Mørk rød Clear prolaps Veldig Soft Mørk rød
3 Brutto Bleeding Omfattende prolaps Diaré Svart
Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL) Eppendorf 0030 120.094
Biotek EL808 Absorbance plate reader BioTek EL808
Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da) MP Biomedicals 160110
Gen5 (software) BioTek Version 1.10.8
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G
Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water Sigma-Aldrich 216763 Store at 2-8°C
Microtest plate 96-well flat bottom Sarstedt Ltd 82.1581 For single use only
o-Dianisidine Sigma-Aldrich D-3252 Light sensitive. Store at 2-8°C
Potassium phosphate, dibasic Caledon 6620-1
Potassium phosphate, monobasic EMD Millipore PX1565-1
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Store at -20°C
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II Qiagen 69997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sands, B. E. From symptom to diagnosis: clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation. Gastroenterology. 126, 1518-1532 (2004).
  2. Danese, S., Fiocchi, C. Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases. World J. Gastroenterol. 12, 4807-4812 (2006).
  3. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).
  4. Axelsson, L. G., Landstrom, E., Goldschmidt, T. J., Gronberg, A., Bylund-Fellenius, A. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+)-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflamm. Res. 45, 181-191 (1996).
  5. Egger, B., Bajaj-Elliott, M., MacDonald, T. T., Inglin, R., Eysselein, V. E., Büchler, M. W. Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis: cytokine profile and dose dependency. Digestion. 62, 240-248 (2000).
  6. Krawisz, J. E., Sharon, P., Stenson, W. F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models. Gastroenterology. 87, 1344-1350 (1984).
  7. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab. Invest. 69, 238-249 (1993).
  8. Smith, J. W., Castro, G. A. Relation of peroxidase activity in gut mucosa to inflammation. Am. J. Physiol. 234, R72-R79 (1978).
  9. Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Kumar-Ondiveeran, H., Verdu, E. F., Collins, S. M. The vagus nerve: a tonic inhibitory influence associated with inflammatory bowel disease in a murine model. Gastroenterology. 131, 1122-1130 (2006).
  10. Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., Nakaya, R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98, 694-702 (1990).
  11. Solomon, L., Mansor, S., Mallon, P., Donnelly, E., Hoper, M., Loughrey, M., Kirk, S., Gardiner, K. The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview. Comparative Clinical Pathology. 19, 235-239 (2010).
  12. Mähler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am. J. Physiol. 274, G544-G551 (1998).
  13. Hans, W., Scholmerich, J., Gross, V., Falk, W. The role of the resident intestinal flora in acute and chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 12, 267-273 (2000).
  14. Rath, H. C., Schultz, M., Freitag, R., Dieleman, L. A., Li, F., Linde, H., Schölmerich, J., Sartor, R. B. Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice. Infect. Immun. 69, 2277-2285 (2001).
  15. Ghia, J. E., Li, N., Wang, H., Collins, M., Deng, Y., El-Sharkawy, R. T., Côté, F., Mallet, J., Khan, W. I. Serotonin has a key role in pathogenesis of experimental colitis. Gastroenterology. 137, 1649-1660 (2009).
  16. Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance. J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).
  17. Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice. Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).
Gransker Intestinal Betennelse i DSS-indusert Modell av IBD
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).More

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter