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Medicine

세분화 및 Murine 비만 모델에서 지방 볼륨 측정 X 선 계산된 Tomography를 사용하여

doi: 10.3791/3680 Published: April 4, 2012

Summary

지방 콘텐츠 분석은 정기적으로 murine 비만 모델을 이용한 연구를 실시하고 있습니다. 작은 동물 중부 표준시 이미징 및 분석의 신흥 방법은 종방향 세부 풍부한 지방이 콘텐츠를 분석 제공하고 있습니다. 작은 동물 중부 표준시 이미징, 분석 및 시각화를 수행하기위한 단계 절차에 의해 여기 세부 단계.

Abstract

비만은 증가 병적 상태와 사망률뿐만 아니라 삶의 질이 감소 통계 수치와 연결되어 있습니다. 질병에 기여하는 정확한 기본 메커니즘은 현재 delineated되고 있지만 두 가지 환경 및 유전적 요인, 비만과 관련된다. 2,3 여러 작은 동물 비만의 모델들이 개발되었으며 연구의 다양한 고용 4.이 실험에 대한 중요한 구성 요소가 다양한 조건 하에서 지역 및 / 또는 총 동물성 지방 콘텐츠 데이터의 수집을 포함한다.

비만 작은 동물 모델에서 지방 콘텐츠를 측정 가능한 전통적인 실험 방법은 침입 (지방 예금의 예 예 생체내 측정)를 포함하고 비침습 (예 : 이중 에너지 X 선 흡광광 도법 (DEXA), 또는 (MR) 공명 마그네틱) 프로토콜, 있는 각각의 상대적인 무역 오프를 제공합니다. 지방 콘텐츠를 측정하기위한 전류 침입 방법은 세부 정보를 제공할 수 있습니다기관 및 지역 특정 지방 분포하지만, 희생에 대한 과목 종방향 평가를 배제합니다. 반대로, 현재 비침습 전략은 기관 및 지역 특정 지방 분포에 대한 제한된 정보를 제공하고 있지만, 귀중한 종방향 평가를 가능하게합니다. 작은 동물 전용 X-레이 계산된 tomography (중부 표준시) 시스템 및 사용자 정의 분석 절차, 기관이 모두 지방 유통 및 세로 파일링 지역의 구체적인 분석의 출현과 함께 수도 있습니다. 최근 보고서는 살아있는 생쥐의 adiposity의 생체내 세로 이미징에 대한 중부 표준시의 사용을 검증했습니다. 5,6 여기에 우리가 함께 Carestream 분자 이미징 Albira 중부 표준시 시스템을 활용하여 총 / 지방 부피 측정, 분석 및 시각화를 허용 수정된 방법을 제공 PMOD 및 Volview 소프트웨어 패키지를 추가로 제공하고 있습니다.

Protocol

1. 동물

  1. 결과는 아래에 보고된 내용은 세 C57BL/6J 마우스 넷 B6.V-Lep 산부인과 / J 생쥐 잭슨 연구소 (바 하버, 메인, 미국)로부터 얻은 것입니다. B6.V-Lep 산부인과 / J 마우스는 비만의 가장 초기 모델 중 하나를 표현하고 적극적으로 연구 남아 있습니다. B6.V-Lep 산부인과 / J 마우스 증가 adipocyte 크기와 수에 의해 특징 표현형을 전시하고 야생 형 마우스보다 세 번까지 무게가 나간다. 여기 7,8, B6.V-Lep 산부인과 / J 생쥐가 긍정적으로 근무 했었습니까? 중부 표준시 기반의 지방 콘텐츠 측정 Albira 중부 표준시 제도의 타당성을 설명하기 위해 비만 표현형에 대한 관리 기능을 제공합니다.
  2. 동물들이 약 12​​ 주 된 도달했을 때 영상이 수행되었다. (B6.V-Lep 산부인과 / J 생쥐의 비만하면 매니 페스트 나이 4 주 후입니다.)
  3. 마우스는 Isofluorane (2.5 % 유량)에 의해 anesthetized있었습니다 및 이미징을위한 코 콘 설정을 통해 2.5 %의 아래에 있었죠.imals는 Albira 이미지 스테이션과 함께 제공되는 기본 쥐의 침대 (M2M 이미징 주식 회사 클리블랜드 오하이오)의 경향이 자리잡고 있었어요. 팔다리는 균일한 CT 담당자 취득에 몸통에서 나온 측면 자리잡고 있었어요.
  4. 이미지 수집이 완료된 후, 생쥐는 코 콘에서 제거하고 외래까지 복구 케이지에 반환되었다.

2. 이미지 수집 및 재건

  1. 이미지 인수는 Albira 중부 표준시 시스템 (Carestream 분자 이미징, 우드 브리지, CT)를 사용하여 수행됩니다. 마우스는 Isofluorane (2.5 % 유량)에 의해 anesthetized있었습니다 및 이미징을위한 코 콘 설정을 통해 2.5 %의 아래에 있었죠. 인수는 600 전망치를 사용하여 115mm 길이의 침대를 검색하도록 수행되었습니다. X 선 소스는 200 μA 45 kVp의 전압 전류로 설정하고, 단단해 보에 0.5 mm 알루미늄 필터를 사용했습니다.
  2. 중부 표준시 설정에 대한 대략적인 방사 선량 깊이에 상응하는 220 MSV 있었고, 얕은 선량에 상응는 357.4 MSV했습니다. 이들복용 20 배보고보다 낮은 LD50 값이 초과 9.
  3. 이미지가 "표준"매개 변수를 사용 Albira 스위트 5.0 Reconstructor 통해 FBP (필터링 백 프로젝션) 알고리즘을 사용하여 복원합니다. 이러한 결합 취득 및 재건 설정은 125 μm의 등방성 voxels로 최종 이미지를 만들어 전체 동물의 분석을위한 충분한 것으로 간주. 세부 지역을 구체적인 분석 내용은, 35 μm의 등방성 voxels와 재건은 90 μm의의 최종 확인을 위해 선택할 수 있습니다.

3. 이미지 분석

이미지 분석 PMOD (PMOD 테크놀로지 (주), 취리히, 스위스) 분석 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 이미지는 전체 볼륨 밀도 최초 조직에 그리고 기름 량에 따라 PMOD에 세그먼트입니다.

3.1 이미지는 전산 수요를 최소화하기 위해 분석을 위해 줄어들 수 있습니다.

  1. 줄이기 위해 기본보기 탭으로 이동합니다. 도구를 선택합니다> 줄입니다.
  2. 2로 2로, 2에서 Y를 X를 선택하고 Z.
  3. 교체하십시오.
  4. 실행을 선택합니다.

메시지 : 감소가 완료되면 디스플레이를 "상자가 변경됩니다 전철".

3.2 이미지는 후속 볼륨의이자 (목소리야) 분석을위한 침대, 코 콘 요소를 제거하기 위해 숨겨 수 있습니다.

  1. 덮으려고, 비행기로 이동, 레이아웃, 돌리기, 미러, 3D 마커> 비행기 및 레이아웃.
  2. 쇼 비행기 Z를 선택합니다.
  3. Z 평면에서 코 콘으로 스크롤합니다.
  4. 메인 목소리야 탭을 선택> 정점을 그립니다.
  5. 동물 주위에 관심을 (ROI)의 영역을 그리 코를 제외한 침대 코 콘합니다.
  6. 선택실제 투자 수익 (ROI)을 복사합니다.
  7. 다음 슬라이스로 이동하고, 코의 관련 비행기를 통해 버퍼로부터 투자 수익 (ROI)을 붙여 넣습니다.
  8. 필요에 따라 ROIs를 조정하려면 편집을 정점의 그룹을 사용합니다.
  9. 코 콘 이후 처음으로 비행기에 투자 수익 (ROI) 삭제를 선택합니다.
  10. 코 콘 이후 처음으로 비행기에 동물의 둘레를 (동물 침대 제외)을 포괄하는 새로운 목소리야를 생성합니다.
  11. 목소리야 도구> 마스킹 및 대수로 이동합니다.
  12. 제공된 대화 상자에서 -1000을 입력합니다.
  13. 선택한 VOIs 버튼 이외의 마스크 voxels를 선택합니다.

메시지 : ". 돌이킬 수없는 데이터 작업을 계속하시겠습니까?" 표시됩니다.

  1. 예를 선택합니다.
  2. 비행기로 이동, 레이아웃, 돌리기, 미러, 3D 마커> 비행기 및 배열웃.
  3. 모든 비행기 표시를 선택합니다.
  4. 무결성에 대한 목소리야를 검사합니다.
  5. 저장을 선택합니다.
  6. 분석으로 저장.
  7. 파일 이름 접두어를 변경합니다.

3.3 첫 번째 세그먼트 전체 동물의 볼륨 이미지

  1. 도구> 외부 선택합니다.
  2. 세그먼트화 확인란을 선택합니다.
  3. -300로 3500 (복부 지방 지역의 밀도 범위에서 파생된 밀도 범위 참조)의 범위를 입력합니다.
  4. 세그먼트 실행을 선택합니다.
  5. 세분화의 무결성을 검사합니다.
  6. 확인을 선택합니다.
  7. 투자 수익 (ROI)를 제거를 선택합니다.
  8. 목소리야 통계를 선택하십시오.

신고된 통계는 전체 볼륨을 나타냅니다.

  1. 보고 볼륨을 기록합니다.

    3.4 다음, 세그먼트 FAT 볼륨에 대한 이미지

    1. 지방 볼륨 분할에 대한 비 세그먼트 가면 이미지로 돌아가기.
    2. 저장 가면 쓴 데이터 파일을로드하려면)로드 창에서 분석 확인란을 선택하십시오.
    3. 도구> 외부 선택합니다.
    4. 세그먼트화 확인란을 선택합니다.
    5. -50에 -200의 범위를 입력합니다.
    6. 세그먼트 실행을 선택합니다.
    7. 세분화의 무결성을 검사합니다.
    8. 확인을 선택합니다.
    9. 목소리야 통계를 선택하십시오.

    보고된 통계 FAT 볼륨을 나타냅니다.

    1. 보고 볼륨을 기록합니다.
    2. 저장을 선택합니다.
    3. 분석으로 저장.
    4. 파일 이름 접두어를 변경합니다.

    옵션 : 피부 / 주변 밀도가 남아있을 경우 아래의 "사방과 팽창"프로토콜이 목소리야 분석을 위해이 지역을 제거하기 위해 수행할 수 있습니다.

    1. 도구> 외부 선택합니다.
    2. 형태학의 확인란을 선택합니다. 형태학의 전망이 표시됩니다.
    3. 사방을 선택합니다.
    4. 확인을 선택합니다.
    5. 도구> 외부 선택합니다.
    6. 형태학의 확인란을 선택합니다. 형태학의 전망이 표시됩니다.
    7. 팽창을 선택합니다.
    8. 확인을 선택합니다.

    4. 중부 표준시 이미지의 시각화

    4.1 VolView v3.2은 (Kitware, 클리프톤 공원, 뉴욕, 미국) 세그먼트의 이미지 렌더링 3 차원 영상 디스플레이를 만드는 데 활용했다.

      분석에서 설정한 중부 표준시 데이터를 엽니다.
    1. 팝업 윈도우의 기본 설정을 사용합니다.
    2. 플러그인 메뉴를 엽니다.
    3. 유틸리티에서 볼륨을 병합을 선택합니다.
    4. Rescale 구성 요소의 선택을 취소하십시오.
    5. 두 번째 입력을 할당을 클릭합니다.
    6. 두 번째 입력을위한 세그먼트 지방이 데이터를 선택합니다.
    7. 팝업 윈도우의 기본 설정을 사용합니다.
    8. 플러그인 적용을 클릭합니다.
    9. 주제 마우스 크게 보려면 두 번 누릅니다 볼륨 뷰 창.

    색상 / 불투명도 탭으로 4.2으로 돌아갑니다. 구성 요소 드롭 다운 상자는 현재 편집중인되는 데이터 집합을 말합니다. 두 개의 슬라이더는 탭의 맨 아래에 위치하고 값은 0을 1로 사용하여 오버레이 내에 설정된 각 구성 요소에 데이터의 상대적인 밝기를 결정합니다. 구성 요소 1 일에 대한전자 CT도, 우리는이 색상을 그레이 스케일을 사용하는 것을 선호합니다. 색상을 변경하려면 :

    1. 스칼라 색상 매핑 섹션에서 색상 슬라이더 중 하나를 두 번 클릭합니다.
    2. 슬라이더를 제거하려면 상자 밖으로 드래그합니다.
    3. 새로운 슬라이더를 추가하려면, 슬라이더 영역 내에 아무 곳이나 클릭합니다.
    4. 슬라이더 중 하나를 제거합니다.
    5. 왼쪽 색상 슬라이더 검정색을 (스칼라 값 (S) = -19000) 확인합니다.
    6. 오른쪽 색상 슬라이더 흰색 ((S) = 15,000)을 확인합니다.
    7. 스칼라 불투명도 매핑 상자에서 상자 안에 클릭하여 새 지점을 만듭니다. 이것은 윈도우의 세 지점의 합계를 제공합니다.
    8. 중간 지점의 경우 ~ -3000로 (S)를 변경하고 불투명도 (O) 값을 0으로.
    9. 창의 오른쪽에서 세 번째 지점을 선택합니다.
    10. 32,000에 (S) 변경하고, 0.25의 G> O.
    11. 첫 번째 요점은, 왼쪽에 어디서든 불투명도 값이 0으로 설정된만큼 긴 될 수 있습니다.
    12. 지방의 모양을 수정해야합니다 컴포넌트 둘,로 변경합니다.
    13. 더블 클릭과 거짓 색지도 빨간색으로 지방에 왼쪽으로 (H) 슬라이더 색조를 밀어서 빨간색으로 색상 슬라이더의 각을 변경합니다. 다른 아주 조금은 지방의 모양을 조정할 필요가되어야합니다.

    중부 표준시, 지방, 그리고 오버레이를 표시 3 패널 회전 영화를 만들려면 4.3 :

    1. 당신을 향하게 돌려 가진 직립 위치에 따라 마우스를 클릭하고 드래그합니다.
    2. 구성 요소 가중치 아래 두에 0에만 중부 표준시 스캔을 표시하는 구성 요소의 값을 설정합니다.
    3. 검토> 카메라를 누릅니다.
    4. 프레임 구경의 번호를 선택R 회전 동영상 (현재 케이스를 위해, 우리는 "36"선택).
    5. 360 도까지 X 회전 값을 변경합니다.
    6. 만들기를 선택합니다.
    7. 팝업 대화 상자에서, CT라는 새 폴더를 만들고 회전 이미지 시리즈를 출력하는 TIFF 형식으로 파일을 저장합니다.
    8. 개별 폴더에 매번 그들을 저장,이 지방이 이미지에 대한 단계뿐만 아니라 오버레이 지방 / 중부 표준시 이미지를 반복합니다.

    4.4 ImageJ V 1.43u는 VolView 출력 이미지를 사용하여 회전 동영상 파일을 생성하는 데 사용되었습니다.

    1. ImageJ에서 파일> 가져오기> 이미지 시퀀스를 선택합니다.
    2. 중부 표준시 폴더의 첫번째 이미지를 선택합니다. 소프트웨어가 자동으로 다른 파일을 탐지하고 스택로 열립니다.
    3. 지방과 오버레이 시퀀스를 엽니다 반복합니다.
    4. 분석하에 투자 수익 (ROI) 관리자를 열고> 도구> 투자 수익 (ROI)관리자.
    5. 불필요한 배경 픽셀 제외 주제 마우스 주변의 투자 수익 (ROI)을 그립니다.
    6. 투자 수익 (ROI) 관리자에서 투자 수익을 추가하려면 추가를 클릭합니다.
    7. 다른 이미지 시퀀스를 선택합니다.
    8. 투자 수익 (ROI) 관리자에서 그림에 적용하는 투자 수익 (ROI)을 클릭합니다. 이 패션에서 잘립니다 스택의 각 완벽하게 매치할 것입니다.
    9. 투자 수익 (ROI)은 모든 스택에있는 경우, 투자 수익 (ROI) 내에서 마우스 오른쪽 단추로 누릅니다.
    10. 복제를 선택합니다.
    11. 이미지의 나머지 부분에서 투자 수익 (ROI)을 분리하는 중복 스택 확인란을 선택합니다.
    12. 큰 이미지 스택을 닫습니다.
    13. 세 이미지 시퀀스에 대해이 절차를 반복합니다.
    14. 이동 영상> 스택> 도구> 함께 스택을 결합하는 결합.
    15. 스택 1 CT를 선택합니다.
    16. 스택 2 뚱땡 선택합니다.
    17. > 반복, 그리고 스택 1과 스택 2를 중첩에 대한 결합 스택을 선택합니다.
    18. 이미지 창의 왼쪽 아래 모서리에서 재생을 선택하면 미리보기가 될 수있는 세 패널, 이미지 회전 스택 지금있다.
    19. AVI로 동영상을 저장하려면 파일을 선택> 다른 이름으로 저장 ...> AVI ...
    20. 저장을 클릭합니다.

    5. 대표 결과

    세 WT (C57BL/6J) 생쥐 넷 비만 (B6.V-Lep 산부인과 / J) 생쥐에 대한 결과가 Albira 중부 표준시 시스템을 채용 지방 / 총 부피 비율 측정의 대표적인 예로 여기에보고됩니다. 그림 1은 아래 담당자에게 제공 비만 생쥐 중부 표준시 이미지의 세분화 (예 : 총 볼륨 및 볼륨)를 VolView v3.2로 만든 표시합니다.

    0/3680fig1.jpg "/>
    1 그림. 대표 중부 표준시 지방을위한 세그먼트 이미지. 그레이 스케일의 () 비만 마우스 (B6.V-Lep 산부인과 / J) 중부 표준시 총 볼륨, 빨간색 (B) FAT 볼륨, 그리고 (C) 이미지 융합. 그레이 스케일의 (D) WT 마우스 (C57BL/6J) 중부 표준시 총 볼륨, 빨간색 (E) FAT 볼륨, 그리고 (F) 이미지 융합.

    총 볼륨, 지방 볼륨 및 계산 지방 / 총 부피 비율은 각 WT 마우스와 각 비만 마우스에 대해 표 1에서 아래보고됩니다. WT 그룹과 비만 그룹에 대한 평균 총 / 지방 부피 비율은 0.09 년과 0.42 (그림 2)했습니다. 비만 생쥐 대 WT 생쥐에 대한 전체 / 지방 부피 비율은 (P = 0.001) 크게 차이가 발견되었다.

    WT (C57BL/6J) 합계 (cm 3) 뚱땡이 (cm 3) 총 / 지방 비율 비만 (B6.V-Lep 산부인과 합계 (cm 3) 뚱땡이 (cm 3) 총 / 지방 비율
    동물 1 28.79 3.00 0.10 동물 1 66.25 26.75 0.40
    동물이 33.25 3.05 0.09 동물이 61.15 26.31 0.43
    동물 세 30.30 2.63 0.09 동물 세 64.19 25.7 0.40
    동물 4 54.25 23.78 0.44

    표 1. 총 볼륨, 볼륨,그리고 WT와 비만 생쥐를위한 지방 / 총 부피 비율. 총 지방 볼륨 PMOD 목소리야 분석을 사용하여 분할 이미지에서 파생되었다.

    그림 2
    그림 2. 비만 생쥐 대 WT 생쥐에 대한 지방 / 총 부피 비율 평균은. 0.09와 0.42은 각각 표시되는 것으로 WT (C57BL/6J)과 비만 (B6.V-Lep 산부인과 / J)에 대한 전체 / FAT 볼륨 비율 평균. (오차 막대는 = 단일 표준 편차). WT 대 비만 총 / 지방 부피 비율은 (P-값 = 0.001) 크게 차이가 발견되었다.

Discussion

여기 B6.V-Lep 산부인과 / J 마우스 활용한 우리 Albira 중부 표준시 시스템을 사용하여 작은 동물 모델에서 지방 콘텐츠 측정을 수행 가능성을 그림했습니다. 이러한 측정은 내부 그룹 간의 그룹 측정의 비교에 대한 기대와 일치합니다. 첫째로, 대표적인 결과는 이러한 절차를 사용하여 두 WT와 비만 생쥐 그룹에서 총 / FAT 볼륨 비율의 측정에 제한 내부 그룹 다양성을 강조 여기에 제공했습니다. 둘째, WT 대 비만 생쥐에 대한 전체 / 지방 부피 비율은 상당히 다릅니다. 마지막으로, WT 대 B6.V-Lep 산부인과 / J 생쥐에 대한 상대적인 총 지방 질량 및 %의 체지방에 대해 보고된 이전 값으로 (표시되지 않음) 비교를 기반으로, WT 대에 대한 전체 / 지방 부피 비율위한 측정 B6.V- Lep 산부인과 / J 마우스는 예상 범위, 7, 8 안에 멸망해.

여기에 설명된 방법은 다른 m에 적용하거나 적응 수odels 및 / 또는 학습 목표. 재건축 매개 변수의 수정은 특정 목표를 달성하기 위해 필요할 수 있습니다. 예를 들어, Judex 외. (2010) 50 μm의 해상도의 이미지가 일부 지역의 구체적인 분석을 위해 필요한 것으로보고했다. 이미지 중 하나 cm 등방성 볼륨은 "HR"재건축 옵션을 사용 Albira 5.0 스위트 Reconstructor 35 μm의 reconstructions에 대해 선택할 수 있습니다. Albira 중부 표준시 시스템은 지역 및 기관의 구체적인 지방 콘텐츠 측정에 활용되면 중부 표준시 기반의 지방 콘텐츠 분석의 완전한 혜택 (예 : 동시 지역 및 기관이 특정 지방 부피 측정과 길이 측정) Albira 중부 표준시 시스템용으로 실현할 수 있습니다.

결론 :

여기에서 우리는 X-레이 중부 표준시 이미징을 사용하여 살아있는 생쥐의 지방 콘텐츠의 측정 단계 방법에 의해 세부적인 단계를 제공합니다. 우리는 중부 표준시 데이터 Albira 이미지 스테이션을 사용하여 설정을 인수하고, 이후의 세분화 및 아나을 수행PMOD 소프트웨어 스위트를 사용하여 용해. 마지막으로, 우리는 전체 동물 내에서 쉽게 이해되는 렌더링과 지방 조직 분포의 시각화를 활성화하는 방법을 제공합니다.

Disclosures

토드 A. 새서, Shengting 리, 숀 P. 오르톤, 그리고 세스 T. 사기는 Carestream 분자 이미징의 직원입니다. 카를로스 Correcher가 Oncovision의 직원이며, 보석 - 이미징, 매튜 Leevy은 Carestream 분자 이미징을위한 컨설턴트 봤어.

Acknowledgments

우리는 따뜻하게이 프로젝트에 대한 재정 지원을위한 노트르담 통합 이미징 시설 (NDIIF)와 Carestream 건강 감사드립니다.

References

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세분화 및 Murine 비만 모델에서 지방 볼륨 측정 X 선 계산된 Tomography를 사용하여
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Sasser, T. A., Chapman, S. E., Li, S., Hudson, C., Orton, S. P., Diener, J. M., Gammon, S. T., Correcher, C., Leevy, W. M. Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography. J. Vis. Exp. (62), e3680, doi:10.3791/3680 (2012).More

Sasser, T. A., Chapman, S. E., Li, S., Hudson, C., Orton, S. P., Diener, J. M., Gammon, S. T., Correcher, C., Leevy, W. M. Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography. J. Vis. Exp. (62), e3680, doi:10.3791/3680 (2012).

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