Summary
Analyse du contenu Fat est effectuée couramment dans les études utilisant des modèles murins d'obésité. Méthodes émergentes en imagerie CT petit animal et de l'analyse fournissent des détails riches analyse longitudinale teneur en matières grasses. Ici pas de détails, nous en étape, les procédures pour effectuer les petits animaux imagerie CT, l'analyse et la visualisation.
Abstract
L'obésité est associée à une morbidité et une mortalité accrues ainsi que des indicateurs réduit la qualité de vie. 1 Les deux facteurs environnementaux et génétiques sont associés à l'obésité, même si les mécanismes précis sous-jacents qui contribuent à la maladie sont actuellement définies. 2,3 animale Plusieurs petits modèles d'obésité ont été développés et sont utilisés dans une variété d'études. 4 Un élément essentiel à ces expériences implique la collecte de données animales régionales et / ou la teneur totale en matières grasses dans des conditions variées.
Les méthodes traditionnelles expérimentales disponibles pour mesurer la teneur en matières grasses de petits modèles animaux d'obésité comprennent invasive (par exemple la mesure ex vivo des dépôts de graisse) et non-invasive (p. ex Dual Energy X-ray absorptiométrie (DEXA), ou par résonance magnétique (MR)) protocoles, dont chacun présente par rapport arbitrages. Les méthodes actuelles invasives pour mesurer la teneur en matière grasse peut fournir des détailspour orgue et de la région de distribution spécifique graisse, mais en sacrifiant les sujets empêchera évaluations longitudinales. A l'inverse, le courant non-invasives stratégies fournir des détails limités pour orgue et de la région de distribution spécifique graisse, mais autorisent de précieuses évaluation longitudinale. Avec l'avènement de petits animaux dédiés aux rayons X la tomodensitométrie (CT) et les systèmes de mesure des procédures analytiques, à la fois d'organes et de l'analyse spécifique de la région la répartition des graisses et le profilage longitudinal peut être possible. Des rapports récents ont validé l'utilisation de la TDM pour l'imagerie in vivo longitudinale de l'adiposité chez les souris vivant. 5,6 Ici nous fournissons une méthode modifiée qui permet de mesurer le volume de graisse / total, l'analyse et la visualisation en utilisant le Carestream Molecular Imaging Albira CT système en collaboration avec des logiciels et PMOD Volview.
Protocol
1. Animaux
- Pour les résultats présentés ci-dessous, trois et quatre souris C57BL/6J B6.V-Lep ob / J souris ont été obtenues à partir de Jackson Laboratories (Bar Harbor, principale, Etats-Unis). B6.V-Lep ob / J souris constituent l'un des premiers modèles d'obésité et de rester activement recherché. B6.V-Lep ob / J souris présentent un phénotype caractérisé par la taille des adipocytes et le nombre accru et peut peser jusqu'à trois fois plus que les souris de type sauvage. 7,8 Ici, B6.V-Lep ob / J souris ont été utilisés comme un point positif de commande pour un phénotype obèse pour illustrer la faisabilité du système Albira CT pour CT de mesures basées sur teneur en matière grasse.
- L'imagerie a été effectuée lorsque les animaux ont atteint environ 12 semaines. (L'obésité chez les B6.V-Lep ob / J souris est manifeste après 4 semaines d'âge).
- Les souris ont été anesthésiées par isofluorane (débit 2,5%) et maintenu sous à 2,5% via une configuration ogive pour l'imagerie. Unimals ont été en décubitus ventral dans le lit de rat standard (M2M Imaging Inc Cleveland, OH) dans fournie avec la station de l'image Albira. Membres ont été placés latérale du torse pour une acquisition uniforme CT.
- Après l'acquisition d'images a été achevée, les souris ont été retirés du cône de nez et est retourné à une cage de récupération jusqu'à ambulatoire.
2. Acquisition d'images et la reconstruction
- Acquisitions d'images sont réalisées en utilisant le système de Albira CT (Carestream Molecular Imaging, Woodbridge, CT). Les souris ont été anesthésiées par isofluorane (débit 2,5%) et maintenu sous à 2,5% via une configuration ogive pour l'imagerie. Les acquisitions ont été effectuées pour analyser un lit de 115 mm de longueur, avec 600 projections. La source de rayons X a été réglé sur un courant de 200 pA et la tension de 45 kV, et utilisé un filtre de 0,5 mm Al durcir le faisceau.
- Approximatif équivalent de dose de rayonnement profond pour les paramètres de CT était de 220 mSv, et équivalent de dose profond était 357,4 mSv. Cesles doses sont plus de 20 fois plus faible que rapporté DL50 9.
- Les images sont reconstruites en utilisant la FBP (rétroprojection filtrée) algorithme via le Reconstructor Albira Suite 5.0 à l'aide "Standard" paramètres. Ces paramètres d'acquisition et de reconstruction combinée de produire une image finale avec 125 um voxels isotropes, jugée suffisante pour l'analyse animal entier. Pour une analyse détaillée région spécifique, une reconstruction avec 35 um voxels isotropes peuvent être sélectionnés pour une résolution finale de 90 um.
3. Analyse d'Image
L'analyse d'image est effectué en utilisant le logiciel d'analyse PMOD (Technologies LTD PMOD, Zurich, Suisse). Les images sont segmentées en fonction de PMOD tissus de densité, d'abord pour le volume total et puis pour le volume de graisse.
3.1 Les images peuvent être réduits pour l'analyse afin de minimiser les demandes de calcul.
- Afin de réduire, accédez à l'onglet Affichage principal. Sélectionnez Outils> Réduire.
- Sélectionner par X 2, Y par deux, et Z par deux.
- Vérifier Remplacer.
- Sélectionnez Exécuter.
Le message: "Le cadre de sélection va changer» s'affiche une fois la réduction est terminée.
3.2 Les images peuvent être masqués pour éliminer les éléments de lit et le nez de cône pour la suite du volume d'intérêt (VOI) l'analyse.
- Pour masquer, accédez à Planes, de dispositions, les rotations, miroirs, marqueurs 3D> Avions amenagement.
- Sélectionnez Afficher plan Z.
- Faites défiler jusqu'à l'ogive dans le plan Z.
- Sélectionnez l'onglet principal VOI> Dessiner sommets.
- Dessiner une région d'intérêt (ROI) autour de l'animal nez hors du lit et le cône du nez.
- SélectionnerCopiez le retour sur investissement réel.
- Passez à la prochaine tranche, et collez le retour sur investissement à partir du tampon à travers les plans pertinents de nez.
- Utilisez Modifier le groupe de sommets pour régler le ROI tant que de besoin.
- Sélectionnez Supprimer ROI sur les premiers avions au-delà des cônes de nez.
- Générer un nouveau VOI pour englober le périmètre des animaux (à l'exclusion du lit des animaux) dans les premiers avions au-delà des cônes de nez.
- Accédez à VOI Outils> Masking & Algèbre.
- Entrez -1000 dans la boîte de dialogue prévu.
- Sélectionnez les voxels Masque en dehors du bouton sélectionné VOIS.
Le message: ". Irréversible opération de données Voulez-vous continuer?" écrans.
- Sélectionnez Oui.
- Accédez à Planes, modèles, rotations, miroirs, marqueurs 3D> Avions & Layouts.
- Sélectionnez l'option Afficher tous les plans.
- Examinez le VOI de l'intégrité.
- Sélectionnez Enregistrer.
- Enregistrer en tant que Analyser.
- Changer le préfixe du nom de fichier.
3.3 Premièrement, segment de l'image pour un volume total de l'animal:
- Sélectionnez Outils> externe.
- Sélectionnez la case à cocher segmentation.
- Entrez une gamme de -300 à 3500 (référence de la plage de densité dérivé de la gamme de densité de graisse abdominale-région).
- Sélectionnez Exécuter segmentation.
- Examiner l'intégrité de la segmentation.
- Cliquez sur OK.
- Sélectionnez Supprimer ROI.
- Sélectionnez les statistiques VOI.
Les statistiques déclarées représentent le volume total.
- Noter le volume rapporté.
3.4 Ensuite, segment de l'image pour le volume des matières grasses:
- Retour à l'image non-segmenté masqué pour les matières grasses volume de segmentation.
- Pour charger le fichier de sauvegarde de données masqué, cochez la case Analyser dans la fenêtre de chargement).
- Sélectionnez Outils> externe.
- Sélectionnez la case à cocher segmentation.
- Entrez une plage de -200 à -50.
- Sélectionnez Exécuter segmentation.
- Examiner l'intégrité de la segmentation.
- Cliquez sur OK.
- Sélectionnez les statistiques VOI.
Les statistiques présentées représentent le volume de graisse.
- Noter le volume rapporté.
- Sélectionnez Enregistrer.
- Enregistrer en tant que Analyser.
- Changer le préfixe du nom de fichier.
- Sélectionnez Outils> externe.
- Sélectionnez la case à cocher morphologique. Les affichages de vue morphologique.
- Sélectionnez l'érosion.
- Cliquez sur OK.
- Sélectionnez Outils> externe.
- Sélectionnez la case à cocher morphologique. Les affichages de vue morphologique.
- Sélectionnez dilatation.
- Cliquez sur OK.
4. Visualisation des images CT
4,1 VolView v3.2 (Kitware, Clifton Park, NY, USA) a été utilisé pour créer des rendus 3D écrans de visualisation d'images segmentées.
- Utilisez les paramètres par défaut dans la fenêtre pop-up.
- Ouvrez le menu des plug-ins.
- En vertu de l'utilitaire, sélectionnez Fusionner les volumes.
- Décochez la case Mettre à l'échelle des composants.
- Cliquez sur Attribuer deuxième entrée.
- Choisissez les données segmentées de graisse pour la deuxième entrée.
- Utilisez les paramètres par défaut dans la fenêtre pop-up.
- Cliquez sur Appliquer plug-in.
- Double-cliquez sur la fenêtre vue de volume pour une vue agrandie de la souris l'objet.
4.2 Retour à l'onglet Couleur / Opacité. Le composant liste déroulante qui se réfère à jeu de données est actuellement en cours d'édition. Deux curseurs sont situés au bas de la patte et à déterminer la luminosité relative de chaque donnée de composante de réglé dans la superposition, en utilisant des valeurs de 0 à 1. Pour la composante 1, ee CT, nous préférons utiliser une palette de couleurs en niveaux de gris. Pour modifier la couleur:
- Dans la section de cartographie scalaire couleur, double-cliquez sur un des curseurs de couleur.
- Pour supprimer un curseur, faites-le glisser hors de la boîte.
- Pour ajouter un nouveau curseur, cliquez n'importe où dans la zone du curseur.
- Retirez l'un des curseurs.
- Faire la gauche curseur de couleur noire (valeur scalaire (S) = -19000).
- Faire bonne couleur curseur blanc ((S) = 15000).
- Dans la boîte de cartographie Scalar opacité, créer un nouveau point en cliquant dans la boîte. Cela vous donnera un total de trois points dans la fenêtre.
- Pour le point milieu, changer le (S) à ~ 3000, et l'Opacité (O) de la valeur à 0.
- Sélectionnez le troisième point à la droite de la fenêtre.
- Changement (s) à environ 32000, et
- Le premier point peut être n'importe où à gauche, aussi longtemps que la valeur d'opacité est réglée à 0.
- Changer de deux composants, ce qui devrait modifier l'aspect de la graisse.
- Changer chacun des curseurs de couleur au rouge en double-cliquant et en glissant le Hue (H) curseur vers la gauche pour faux-couleur de la carte de la graisse au rouge. Très peu de choses ne devrait être nécessaire d'ajuster l'apparence de la graisse.
4.3 Pour créer un film de rotation à trois panneaux affichant le CT, la graisse, et la superposition:
- Cliquez et faites glisser la souris l'objet dans une position verticale avec le dos face à vous.
- En vertu de poids des composants, définissez la valeur de la composante de deux à 0 pour afficher seulement le scanner.
- Cliquez examen> Appareil photo.
- Sélectionnez un nombre de trames for le film de rotation (dans le cas présent, nous avons choisi "36").
- Modifiez la valeur de rotation X à 360 degrés.
- Sélectionnez Créer.
- Dans la boîte de dialogue pop-up, créer un nouveau dossier nommé CT, et enregistrez le fichier au format TIFF, qui va afficher une série d'images de rotation.
- Répétez cette étape pour l'image grasse, ainsi que pour la superposition de matières grasses / CT image, de les enregistrer dans des dossiers individuels à chaque fois.
4,4 v ImageJ 1.43u a été utilisé pour générer un fichier vidéo de rotation en utilisant les images de sortie VolView.
- Dans ImageJ, sélectionnez Fichier> Importer une séquence d'images>.
- Sélectionnez la première image dans le dossier CT. Le logiciel détecte automatiquement les autres fichiers et les ouvrir comme une pile.
- Répétez l'opération pour ouvrir les séquences de graisse et de superposition.
- Ouvrez le gestionnaire de ROI sous Analyser> Outils> ROIManager.
- Dessiner un retour sur investissement autour de la souris l'objet, à l'exclusion des pixels de fond inutiles.
- Dans le gestionnaire de ROI, cliquez sur Ajouter pour ajouter le retour sur investissement.
- Sélectionnez une séquence d'images différentes.
- Dans le gestionnaire de ROI, cliquez sur le ROI de l'appliquer à l'image. De cette façon, chacune des piles récoltées sera correspondent parfaitement.
- Lorsque le retour sur investissement est sur toutes les piles, faites un clic droit dans le retour sur investissement.
- Sélectionnez Dupliquer.
- Sélectionnez Cochez la case de la pile en double pour séparer le ROI du reste de l'image.
- Fermez les piles d'images plus grandes.
- Répétez cette procédure pour tous les trois séquences d'images.
- Allez à Image> Stacks> Outils> Combiné de combiner les piles ensemble.
- Sélectionnez la TDM pour la pile 1.
- Sélectionnez Fat pour Stack 2.
- Il ya maintenant un à trois panneaux, l'image-rotation pile qui peut être prévisualisé en sélectionnant Lecture dans le coin inférieur gauche de la fenêtre d'image.
- Pour enregistrer la vidéo au format AVI, sélectionnez Fichier> Enregistrer sous ...> AVI ...
- Cliquez sur Enregistrer.
5. Les résultats représentatifs
Résultats pour trois WT (C57BL/6J) et quatre souris obèses (ob B6.V-Lep / J) chez la souris sont présentés ici comme un exemple représentatif de la graisse / total des mesures rapport volume employant le système Albira CT. Figure 1 ci-dessous fournit un représentant affichage créé avec VolView v3.2 pour la segmentation (c.-à-volume total et le volume de graisse) des images obèses souris CT.
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Figure 1. Représentant des images CT segmentés pour les matières grasses. (A) Obésité souris (B6.V-Lep ob / J) CT volume total en niveaux de gris, (B) le volume de graisse dans rouge, et la fusion d'images (C). (D) WT souris (C57BL/6J) CT volume total en niveaux de gris, (E) le volume de graisse dans le rouge, et la fusion d'images (F).
Les volumes totaux, les volumes de matières grasses, et calculés des ratios de volume de graisse / total sont présentés ci-dessous dans le tableau 1 pour chaque souris WT et chaque souris obèses. Le rapport de volume moyenne graisses / total pour le groupe WT et le groupe obèse était de 0,09 et 0,42 respectivement (figure 2). Les rapports de volumes de graisse / total pour les souris WT par rapport aux souris obèses a été trouvé une différence significative (p = 0,001).
| WT (C57BL/6J) | Total (cm 3) | Fat (cm 3) | Fat / Ratio du total des | Obésité (B6.V-Lep ob | Total (cm 3) | Fat (cm 3) | Fat / Ratio du total des |
| Animal 1 | 28,79 | 3,00 | 0,10 | Animal 1 | 66,25 | 26,75 | 0,40 |
| Animal 2 | 33,25 | 3,05 | 0,09 | Animal 2 | 61,15 | 26,31 | 0,43 |
| Animale le 3 | 30,30 | 2,63 | 0,09 | Animale le 3 | 64,19 | 25,7 | 0,40 |
| Animal 4 | 54,25 | 23,78 | 0,44 |
Tableau 1. Le volume total, volume graisseux,et les ratios de volume de graisse / total pour les souris WT et obèses. volumes totaux et matières grasses ont été à partir d'images segmentées en utilisant PMOD VOI analyse.
Figure 2. En moyenne des ratios de volume de graisse / total pour les souris WT par rapport à des souris obèses. En moyenne des ratios de volume de graisse / total pour WT (C57BL/6J) et obèses (ob B6.V-Lep / J) qui se trouvent à 0,09 et 0,42, respectivement, sont affichées. (Barres d'erreur = écart-type unique). WT par rapport obèses ratios de volume de graisse / total ont été trouvés à différer de manière significative (valeur p = 0,001).
Discussion
Ici, en utilisant B6.V-Lep ob / J souris, nous avons illustré la faisabilité d'effectuer des mesures teneur en matière grasse dans un petit modèle animal en utilisant le système Albira CT. Ces mesures sont conformes aux attentes pour les comparaisons intra-groupe et inter-groupes de mesures. Tout d'abord, des résultats représentatifs fournie ici mettre en évidence limitée variabilité intra-groupe dans les mesures de rapports de volume de graisse / total dans les deux groupes de souris WT et obèses qui utilisent ces procédures. Deuxièmement, les ratios de volume de graisse / total pour les souris WT par rapport obèses diffèrent de façon significative. Enfin, sur la base de comparaisons (non représenté) avec les valeurs précédentes par rapport déclarés pour la masse grasse totale et la masse grasse corporelle pour cent pour WT par rapport B6.V-Lep ob / J souris, nos mesures en matière de ratios de volume de graisse / total pour WT par rapport B6.V- Lep ob / J souris restent dans une fourchette attendue, 7, 8.
Les méthodes décrites ici pourrait être appliquée ou adaptée à d'autres modèles et / ou objectifs de l'étude. Modifications des paramètres de reconstruction peut être nécessaire pour atteindre les objectifs spécifiques. Par exemple, Judex et al. (2010) a rapporté que 50 images à haute résolution um ont été nécessaires pour une analyse région spécifique. Un cm volumes isotropes d'une image peut être sélectionné pour 35 reconstructions um dans le Reconstructor Albira Suite 5.0 en utilisant l'option «RH» de reconstruction. Une fois le système Albira CT a été utilisée pour la région et de l'orgue mesures spécifiques à teneur en matière grasse de tous les avantages (c.-à-région simultanée et d'organes spécifiques des mesures de volume de graisse et de mesures longitudinales) de CT analyse de contenu basé sur la graisse peuvent être réalisées pour le système Albira CT.
Conclusions:
Ici, nous fournir une description détaillée, étape par étape la méthode pour la mesure de teneur en matières grasses chez les souris vivantes en utilisant des rayons X d'imagerie CT. Nous avons acquis nos données CT fixe à l'aide d'une station d'image Albira, et effectué une segmentation ultérieure et Analyse en utilisant la suite logicielle PMOD. Enfin, nous fournissons des instructions pour activer le rendu facile et la visualisation de la distribution du tissu adipeux dans l'animal entier.
Disclosures
Todd A. Sasser, Shengting Li, Sean P. Orton, et Seth T. Gammon sont des employés de l'imagerie moléculaire Carestream. Carlos Correcher est un employé de Oncovision, Gem-Imaging SAW Matthew Leevy est un consultant pour l'imagerie moléculaire Carestream.
Acknowledgments
Nous remercions chaleureusement la Notre-Dame intégré Imaging Facility (NDIIF) et de Carestream Health pour un soutien financier pour ce projet.
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