En. Generasjon Kortsiktige Menneskelig Antigen-spesifikke CD8 T-celle Lines 7 Separate perifert blod mononukleære celler (PBMCs) fra blodet til friske HLA-A2 positive givere ved hjelp Ficoll-Paque pluss. Tilsett 2 ml / brønn av PBMC i 6-brønners plater ved 2 x 10 6 celler / ml. Legg HLA-A2-bindende HER-2/neu p369-377-peptid (aminosyresekvens KIFGSLAFL) eller HLA-A2-bindende influensa P58-66 peptid (GILGFVFTL) direkte til brønnene i en sluttkonsentrasjon på 10 pg / ml og plass i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2. For å bidra til å stimulere og ekspandere T-celler, tilsett, etter 2 dager, 250 ul / brønn friskt medium supplert med humant rekombinant IL-2 (lager: 50 enheter / mL) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 50 enheter / ml i kultur medium. Re-stimulere dyrke celler med 2 x 10 celler / ml 6 bestrålte autologe PBMC pulset i 2 timer med 10 ug / ml av de samme peptidene bruked i trinn 1.3, og legge disse cellene til kulturene ved 1 ml / brønn av en uke etter den første peptid stimulering. Legg humane rekombinante IL-2 og friskt medium, som beskrevet i trinn 1.4, i de eksisterende kulturer hver 2 dager. Re-stimulere cellene med peptid og bestrålt autolog PBMC, som beskrevet i trinn 1.5 en uke etter den andre peptiddel stimulering. Forbered deg på å bruke celler seks dager etter den siste re-stimulering tidligst. 2. Utarbeidelse av brystkreft celler Plasser xCelligence impedans måling stasjon (xCelligence stasjon) i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2. Høste humane tumorceller (SKBR3, BT20, MCF7 eller HCC1419) som er 75% konfluent med 0,25% trypsin og sentrifugering (1000 rpm i 5 minutter). Telle tumorceller ved hjelp av et hemocytometer og gjeninnføre dem i RPMI media tumor (supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 500 enheter / mlIFN-y) ved en konsentrasjon på 7,5 x 10 3 svulst cells/100 mL. Programmer xCelligence programvare ved å sette opp oppsettet for å bestemme godt layout og ved å sette opp timeplanen for å ta impedans målinger hvert 5. minutt for en 40 timers periode. For de første 18 timer, vil xCelligence systemet ta impedans målinger av kreftceller bare. Tilsett 100 ul av RPMI tumor-media til xCelligence E-plater og lesing utføre en bakgrunn ved å måle impedansen i fravær av celler. Legg kreftceller til e-plater på 100 mL per brønn og plass i xCelligence stasjon. Trykk på startknappen på xCelligence programvare for å begynne å ta impedans målinger av kreftceller, som umiddelbart begynner å følge E-plater. 3. Co-kultur Tumor med CD8 T-celler Når kreftceller har festet og doblet til 1,5 x 10 4 tumorceller per brønn (calag 18 timer etter første omgang være belagt), innhøsting T-celler utarbeidet i § 1 ved forsiktig skraping og agitasjon Sentrifuger ved 1000 rpm i 5 minutter, og telle-T-celler ved hjelp av et hemocytometer og gjeninnføre dem i RPMI medium med 10% FBS ved forskjellige forhold, som starter på et maksimalt forhold på en tumorcelle til 40 T-celler og fortynn 2 ganger inntil et forhold på en tumor celle til 1,25 T-celler er nådd. For eksempel er det 1,5 x 10 4 tumor celler per brønn. For å oppnå en 1:40 ratio, tilsett 6 x 10 5 T-celler per brønn og fortynne T-cellene to ganger før en ratio på 1,5 10 4 x kreftceller til 1,875 x 10 4 T-celler per brønn (1:1.25 ratio) er oppnådd. Pause xCelligence stasjon og ta av E-plate. Fjern materialet i brønnene med en pipette og tilsett 200 ul medium alene, eller den passende forhold av T-celler til brønnene. Plasser E-platen tilbake i xCelligence stasjon og fortsette xCelligence programvare program så impedans målinger er tatt hvert 5. minutt i ca 20 timer etter T-celle tillegg. Normaliser resultatene ved slutten av analysen. 4. Krom Slipp analyse (CRA) 7 Følg institusjonelle stråling sikkerhetsprosedyrer når man jobber med 51 Cr og 51 Cr-merket målceller. Bruk alltid egnet skjerming for å redusere stråling. Puls-tumorceller i 2 timer ved 1 x 10 6 tumor celler / ml med 10 ul / ml frisk 51 Cr (0.005 Ci / ml). Vask tumorceller i 10 ml RPMI medium med 10% FBS og sentrifuger ved 1000 rpm i 5 minutter. Legg tumorceller til en 96-brønns rundbunnet plate på 1 x 10 5 tumorceller i 100 ul / brønn. Legg T-celler ved forskjellige forhold, begynner på en tumorcelle til 40 T-celler og fortynn 2 ganger inntil et forhold på en tumorcelle til 1,25 T-celler er oppnådd. For eksempel er det en x 10 5 kreftceller per brønn. For å oppnå en 1:40 ratio, legger 4 x 10 6 T-celler per brønn og fortynne T-cellene to ganger før en ratio på 1 x 10 5 kreftceller til 1,25 x 10 5 T-celler per brønn (1:1.25 ratio) er oppnådd. Legg spontane og maksimal tumorceller kontroller til plate. For å beregne den spontane frigjøring av 51 Cr fra tumorcellene, tilsett seks brønner som hver inneholder en 10 x 5 tumorceller i 100 pl til 100 ul av RPMI medium med 10% FBS. For å beregne maksimum frigjøring av 51 Cr fra tumorcellene, tilsett seks brønner som hver inneholder en 10 x 5 tumorceller i 100 pl til 100 ul 0,1% Triton X-100 i PBS, som lyserer alle celler. Inkuber platene i 5 timer ved 37 ° C med 5% CO2. Etter inkubering, fjernes 50 ul av supernatanten fra hver brønn og legge den til en Luma plate. Tørke platene over natten og måle CPM bruker en Gamma Counter. le "> 5. Prosent Lysis Beregning Impedans analyse: Ta impedans lesing, rapportert som cellen index (CI), på ulike tidspunkter og bruker følgende formel for å bestemme prosent lysis: (CI svulst bare – (CI tumor + T celler)) / (CI svulst only) * 100. CRA: Bruk følgende formel for å bestemme prosent lysis: (CPM eksperimentell – CPM spontan) / (CPM maksimum – CPM spontan) * 100. 6. Representant Resultater T celler alene ikke øker impedans T-celler, generelt, ikke holder seg til de fleste faste overflater og ikke krever tilslutning for aktivering og spredning. Derfor var det en hypotese om at T-celler ikke skal bidra til impedansen på xCelligence E-platene. For å teste dette, ble brønner lastet med enten SKBR3 brystkreft celler eller ferske rensede humane CD8 T-celler. Impedans ble målt i løpet av 40 timer, og et representativt eksempel demonstRangeringen det vesentlige liten effekt på T-celler er vist i figur 1A. I kontrast, kan det argumenteres for at T-celler kan redusere bakgrunn impedans, om enn bare litt. Til tross for det, avslørte co-kultur som prosessen med å legge T-celler på 18 timer etter start av impedansmålinger resulterte i en impedans avbrudd (figur 1B). Andre studier viste at forstyrrelser var delvis på grunn av håndtering ettersom reduksjon i signalet kan reduseres ved å sikre at temperaturen av den T-celle-holdige løsning var det samme som det indre av inkubatoren. Reduksjoner i impedans mediert av T-celler er doseavhengige. Nytten av en impedans-basert assay for å sammenligne prøvene for cytotoksisk T-celle aktivitet krever evne til å skille mellom forskjellige konsentrasjoner av antigen-spesifikke T-celler. For å teste om dette er mulig, var SKBR3 celler co-kultiverte med varierende konsentrasjonsjoner av T-celler avledet fra en HER-2/neu p369-spesifikke T-celle linje. Som vist i figur 2A er det sett redusert impedans avhengig av dose av T-celler. Figur 2b viser at celle-indeksene ved 10 timer følge en enkel andre ordens polynom over området av T-celler. Dermed overvåker xCelligence stasjon CD8 T-celle mediert død SKBR3 svulster i sanntid som en dråpe i celle indeksen. Den impedans-baserte analysen påviser antigen-spesifikke T-celler For å bestemme om reduksjoner i impedans på SKBR3, som er et HER-2/neu og HLA-A2 positiv brystkreft tumor cellelinje, ved HER-2/neu p369-spesifikke T-celler var antigenspesifikk, separate brønner inneholdende SKBR3 ble også inkubert med T-celler avledet fra et influensa (FLU)-spesifikke T-cellelinje. Influensa spesifikk-T-celler fungerte som en uspesifikk kontroll, å være HLA-A2 positive, men ikke har noen evne til å gjenkjenne HER-2/neu. Som vist i Figure 3, er det en betydelig forskjell mellom den lytisk aktivitet av HER-2/neu p369-spesifikke T-celler i forhold til FLU-spesifikke T-celler (p <0,0001). I noen tilfeller kan T-celler ikke spesifikk for tumor (f.eks FLU-spesifikk eller anti-CD3/anti-CD28 stimulert) viste en lav grad av lytisk aktivitet (figur 3A-B). T-celler kan drepe på én av to måter, enten ikke-spesifikt gjennom Fas: Fas ligand interaksjoner eller antigen-spesifikt gjennom utgivelsen av granzymes og perforins. For ytterligere å underbygge den oppfatningen at HER-2/neu-specific T-celler ble drept i en antigen-spesifikk måte, innlemmet vi en blokkerende antistoff til Fas-ligand. Som vist i figur 3B, hvor antistoffet ikke redusere den lytisk aktivitet av HER-2/neu p369-spesifikke T-celler. Antistoffet kan inhibere interaksjoner mellom Fas-og Fas-ligand, som vist med T-celler som var ikke-spesifikt aktivert med anti-CD3/CD28 perlene. Disse resultatene tyder på at nårtumor-spesifikke T-celler er testet med ikke-tumor-spesifikke T-celler, kan Fas ligand blokade være nødvendig for å redusere ikke-TCR-mediert interaksjoner til et minimum. Alternativt, ved bruk av kortvarige dyrkede T-celler linjer i hvilken bare en liten del av de T-celler er spesifikke for antigenet som brukes for ex vivo generering, kan muligheten for MHC mismatch-mediert T-celleaktivering forekomme som fører til ikke-spesifikk lysis. I dette tilfelle kan tilsetningen av antistoffer som blokkerer de irrelevante Hlas være berettiget. For å bestemme om de p369-spesifikke T-celler ble drepe tumorceller i en HLA klasse I avhengig måte, enten anti-HLA-klasse I-antistoff eller isotype kontroll-antistoff ble tilsatt til de ko-kulturer. Som vist i figur 3C, lysering av p369-spesifikke T-celler ble undertrykt ved inkludering av antistoff demonstrerte HLA klasse I begrensning. Til slutt, siden utviklingen av denne analysen ble i stor grad gjort ved hjelp SKBR3, var det viktig å finne ut om andre tilhenger HLA-A2 og HER-2/neu uttrykker kreftceller kan bli drept av p369-spesifikke T-celler. Således ble T-cellene fremstilt og tilsatt i et 01:05 forholdstall til HLA-A2 og HER-2/neu-expressing tumorceller, SKBR3, MCF-7, og HCC1419 celler. HLA-A2-negativ tumor cellelinje, ble BT20 brukt som en negativ kontroll. Som vist i figur 3D, alle av disse ytterligere tumorceller, bortsett BT20 døde også vurdert ved impedans. Således synes fremgangsmåten å være nyttig for flere mål adherente tumorceller. Den impedans-baserte analysen er mer følsom enn den standard krom frigjøring assay for å påvise cytotoksisk T-celle aktivitet Krom (51 Cr) utgivelsen analysen (CRA) som måler cytolytisk aktivitet har lenge vært gullstandarden ved å overvåke CD8 T-celle responser. I denne analysen blir målceller (f.eks tumorceller) merket med 51 Cr. I de fleste tilfeller kan friske målceller beholde mesteparten avradiomerke i løpet av analysen. CD8 T-celler tilsettes til målcellene, vanligvis ved varierende konsentrasjoner, og dreping av målcellene detekteres ved frigjøring av 51 Cr inn i mediet. Bortsett fra det faktum at den bruker farlig stråling, to store problemer med stati er en mangel på følsomhet, og at analysen krever vanligvis store mengder av CD8 T-celler, noe som begrenser dets nytte. For å avgjøre om impedans-baserte analysen var mer følsom enn de CRA, HER-2/neu p369-spesifikke T-celler ble generert in vitro og anvendt, i varierende mengder, på e-plater som inneholder umerkede kreftceller eller standard polypropylen plater som inneholder 51 Cr-merket målceller. Målinger, enten impedans eller gratis krom, ble målt til fem timer etter T-celle tillegg. Figur 4, et representativt eksempel, viser impedans analyse utkonkurrerer krom utgivelsen. Den intra-assay variasjonav den impedans-baserte analysen er vanligvis under 20%. Intra-assay variasjon ble undersøkt, ettersom større bruk av denne analysen blir i stor grad bestemt av dens reproduserbart og variasjon (figur 5). To p369-spesifikke T-cellelinjer ble generert uavhengig 30 dager fra hverandre og tilsettes i triplikat over et område av tumor celle til T-celle-forhold. Det innfelte grafen i Figur 5 viser at linjene var i stor grad tilsvarende i form av Lysing SKBR3 celler. Den% variasjonskoeffisienten ble beregnet ved hver celle-forhold og plottes. Som vist i figur 5, 01:40 til 01:05 forholdstall% variasjonskoeffisient (CV) var under 15%. På 1:2.5 og 1:1.25, men var CV'er høy eller uforutsigbar. På grunn av utstrakt biologisk variasjon, er det ikke mulig å måle inter-assay variabilitet med primære T-celle-linjer. <br /> Figur 1. Impedans trenger å bli normalisert ved tilsetting av T-celler. Panel A: viser at kreftceller (rød linje) og ikke T-celler (blå linje) er ansvarlig for impedans. Vist er de impedans tracings over 40 timer for enten svulst eller T celler alene. Lignende resultater ble oppnådd fra et andre eksperiment. Merk at signalet perturbasjon på cirka 20 timer representerer punktet for tilsetning av T-celler til brønnene som ikke inneholder tumorceller Panel B:. Viser at impedansmålinger blir forbigående avbrytes ved tilsetning av T-celler til kreftceller. Dette krever vanligvis på et eller annet tidspunkt etter tilsetningen av T-celler (se punkt av normalisering markert på grafen). Spor er sammensatt fra repeterende datapunkt. Sporet for kreftceller alene er vist i rødt. De andre sporene representere kreftceller samtidig dyrket med HER-2/neu p369-spesifikke T-celler (Blå: ratio på 1,25 T celler / svulst celle, Green:ratio på 40 T-celler / svulst celle). Hver trase beregnes fra repeterende datapunkt samlet hvert 5. minutt gjennom varigheten av kulturen. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. Klikk her for å se større figur . Figur 2. Reduksjon i impedans mediert av T-celler er doseavhengig. Panel A: Vist er de impedans spor av SKBR3 tumorceller inkubert alene eller med varierende konsentrasjoner av tumor-spesifikke T-celler. Hver trase beregnes fra triplikate datapunkter samlet hvert 5. minutt gjennom varigheten av kulturen. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter Panel B:. Vises er cellen indeksene på 10 timer over hele T-celle / svulst celle konsentrasjoner. Den stiplede linje representerer den celle indeks for tumorceller alen. Hvert symbol er den gjennomsnittlige (± SEM) av tre eksemplarer bestemmelser. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. Klikk her for å se større figur . Figur 3. Den impedans baserte analysen påviser antigen-spesifikke cytotoksiske T-celleresponser. Panel A viser nivået på lyse av SKBR3 celler ved HER-2/neu p369-spesifikke T-celler (Red) eller influensa-spesifikke T-celler (blå) på 5, 10, og 15 timer etter co-kultur. Hvert datapunkt er gjennomsnittet (± SEM) på triplikate målinger. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. Panel B viser lyse av SKBR3 av p369-spesifikke T-celler eller ikke-spesifikt aktiverte T-celler, viser at antigen-spesifikk lysis er ikke på grunn av Fas-Fas ligand interaksjoner. Svarte linjene representerer co-kulturer sominneholdt en Fas-ligand-antistoff. Hver søyle er den gjennomsnittlige (± SEM) lysis i triplikat ved 5 timer etter tilsetning av T-celler. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. Panel C viser lysis 10 timer etter T-celle tillegg av SKBR3 av p369-spesifikke T-celler er HLA-klasse I avhengige. Enten HLA-klasse I blokkering eller isotype kontroll ble lagt under co-kultur. Hver søyle er den gjennomsnittlige (± sem) lysis i tre eksemplarer. Dette forsøk ble gjentatt to ganger med lignende resultater. Panel D angir% lysering 10 timer etter T-celle tillegg av flere HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing tumorcellelinjer med p369-spesifikke T-celler. BT20, ble en HLA-A2-negative brystkreft cellelinje brukt som en negativ kontroll. Hver flekk representerer et unikt eksperiment beregnet ut fra tre eksemplarer bestemmelser. Klikk her for å se større figur . <img src = "/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg" alt = "Figur 4" /> Figur 4. Den impedans baserte analysen er mer følsom enn den krom frigjøring assay for påvisning av tumor-antigen-spesifikke T-celler. Vist er% lyse av SKBR3 i respons til varierende konsentrasjoner av p369-spesifikke T-celler som målt ved 5 timer etter tumor-og T-celle blanding ved å bruke både impedans-baserte analysen og krom frigjøring analysen. Hvert symbol er den gjennomsnittlige (± SEM) av tre gjentak. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. Figur 5. % Intra-assay koeffisienter av variasjon av impedans-baserte T-celle-cytotoksisitet. Assay er middelverdier (± SD)% Intra-assay variasjonskoeffisient til lysis av SKBR3 over et område av konsentrasjoner av antigen-spesifikke T-celler. Hvert symbol er gjennomsnittet av tre gjentak. Tallene som vises i grafen er tHan mener% CVer. Inset panelet viser bety (± sem, n = 3)% lysis av SKBR3, med varierende konsentrasjoner av p369-377-spesifikke T-celler. To uavhengig genererte p369-spesifikke T-cellelinjer med T-celler fra to separate givere er vist.