Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Hybridisering doi: 10.3791/3709 Published: June 28, 2012

Summary

Tidsmæssige og rumlige genekspressionsanalyser har en afgørende rolle i funktionel genomforskning. Whole-mount hybridisering

Abstract

Myg er vektorer for et bredt sæt af patogener, herunder arbovira og protozoparasitter og nematoder. Undersøgelse af udskrifter og gen-regulatorer, der er udtrykt i væv, hvor myg vært og patogen interagere og i organer involveret i reproduktion er af stor interesse for strategier til at reducere myg-bårne sygdomme transmission og forstyrre æg udvikling. En række værktøjer er blevet anvendt til at undersøge og validere den tidsmæssige og vævsspecifik regulering af genekspression. Her beskriver vi protokoller, der er blevet udviklet for at indhente geografisk information, der øger forståelsen af, hvor specifikke gener udtrykkes, og deres produkter akkumuleres. Den beskrevne protokol er blevet anvendt til at validere ekspression og bestemmelse akkumulering mønstre af transkripter i væv i forbindelse med myg-bårne patogen transmission, såsom kvindelige spytkirtler, såvel som subcellulære rum i ovarier og embryoer, der resent at myg reproduktion og udvikling.

De følgende procedurer repræsenterer et optimeret metode, der forbedrer effektiviteten af ​​forskellige trin i protokollen, uden tab af målspecifikke hybridiseringssignaler. Retningslinjer for RNA-probe fremstilling er dissektion af bløde væv og den generelle procedure til fiksering og hybridisering som beskrevet i del A, mens trin specifikke for indsamling, fiksering, præ-hybridisering og hybridisering af myg embryoer er beskrevet i del B.

Protocol

A. Hybridisering in situ til bløde væv: Mosquito spytkirtler og ovarier

Opskrifter løsninger og puffere, der er nødvendige for følgende procedurer er skitseret i tabel 1.

1. RNA Probe Forberedelse og kvalitet analyse

  1. Designe primere til PCR amplifikation af transkriptet målet af interesse. Det anbefales, at ampliconen er ≥ 600 nukleotider i længde og endnu vigtigere at amplikonet sekvensen er unik for målet transkript. Sekvenser, som er ikke-unikke undgås, at eliminere muligheden for at generere krydsreaktive RNA-prober.
  2. Klone PCR-produktet ind i PCR4-TOPO-vektoren, eller lignende kloningsvektor. Den PCR4-TOPO kloningsvektor indeholder T7 og T3-RNA-polymerase priming-steder, der muliggør produktion af både sense-og antisense afstrømning transcription produkter fra en enkelt klon.
  3. Sekvensen af ​​det klonede amplikon at kontrollere sekvensen FIDelity og orientering i vektorplasmidet.
  4. Udføre en restriktionsfordøjelse reaktion med et enzym egnet til fremstilling af en antisense in vitro transcription produkter. Plasmid linearisering fremstilles let ved at vælge et restriktionssted placeret i det multiple kloningsområde i PCR4-TOPO-vektoren, såsom Spe I, PstI eller Not I. Sikre, at den valgte restriktionsstedet ikke er til stede i det klonede fragment. Den samme klon kan anvendes til at generere en sense-streng RNA-probe, der tjener som baggrund kontrol. Hybridisering in situ med en sense probe bør give lidt eller intet signal, når sammenlignet med den komplementære antisense-proben.
  5. Verificere ved gelelektroforese at PCR4-TOPO klon helt lineært.
  6. Oprense lineariserede plasmid-DNA ved at udføre en phenol-chloroform ekstraktion efterfulgt af ethanolpræcipitation. Når udfælde plasmid-DNA'et anbefales det at anvende en endelig concentration af 2 M ammoniumacetat med 2,5 volumener ethanol for at reducere overførsel af restsalt i in vitro transcription reaktionen.
  7. Klargør digoxigenin (DIG)-mærket enkeltstrenget RNA-probe ved at udføre en run-off in vitro transcription reaktionen ved hjælp af 1 pg af det lineariserede plasmid-DNA som skabelon. Forberede reaktion med RNA-polymerase, transkription puffer og DIG RNA mærkning blanding som beskrevet i producentens instruktioner.
  8. Oprense DIG-mærkede in vitro transcription produkter ved ethanolfældning og resuspender pelleterede RNA i DEPC-behandlet destilleret vand.
  9. Verificere kvaliteten og forventede molekylvægt af det oprensede DIG-mærket RNA-probe med formaldehyd gelelektroforese. Den fremstillede RNA-probe kan opdeles i alikvoter og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

2. Dissektion af Mosquito spytkirtler og æggestokke

  1. Dissekere myg spyt GLANds anvendelse af en probe og tang, som beskrevet tidligere for Ae. aegypti. 1,2 For An. gambiae, spytkirtlerne kan dissekeres som beskrevet for Ae. aegypti, eller alternativt som beskrevet i MR4 Methods for Anopheles Research manual. 3
  2. Dissekere myg ovarier med pincet som beskrevet tidligere for Ae. aegypti. 4 kort, kan du bruge en tang til at tage fat i brystkassen, mens en anden tang trækker væk fra næstsidste abdominale segment at frigive æggestokkene.
  3. Indsamle dissekerede spytkirtler eller ovarier i Ambion RNAse-fri 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 50 gl PBS.
  4. Prøverne opbevares på is indtil fiksering.

3. Fiksering

  1. Rette dissekerede væv i friskfremstillet blødt væv fikseringsopløsning (tabel 1) ved stuetemperatur under nutation i 30 minutter til 1 time. Fikseringen Opløsningen fremstilles frisk at forhindre oxidation af formaldehyd fiksativ. Fiksering til 1-1,5 timer anbefales til spytkirtlerne. Et minimalt volumen af ​​1 ml anbefales til fiksering væv i et 1,5 ml mikrofugerør.
  2. Tillade væv at sedimentere til bunden af ​​mikrofugerøret. Dette er et vigtigt skridt, som følger alle ændringer af løsninger i protokollen og vil begrænse prøve tab.
  3. Dekanteres fiksering løsning ved omhyggelig pipettering, efterlader 50-100 gl volumen i mikrofugerør, og derefter vaske 3 ×, 5 min hver med PBT.
  4. Valgfri ækvilibreringstider trin for væv opbevaring. Trinvis skylles ud PBT med enten ethanol eller methanol. Udfør trinvise vaskninger med PBT / alkohol (03:01, 01:01 og 01:03, 5 minutter hver). Opbevares i 100% (200 proof) alkohol ved -20 ° C. Væv kan opbevares i adskillige måneder uden nedbrydning af væv ultrastruktur. Før du udfører efterfølgende trin i protokollen, skal væv tilbage til PBT ved trinvis ligevægt med alkohol / PBT (3:1, 1:1,1:3, 5 minutter hver).
  5. Udfør PBT vasker 3 ×, 5 min hver.
  6. Udføre protein fordøjelse med 0,01 mg / ml Proteinase K / PBT, 5 minutter ved stuetemperatur. Alternativt, hvis begge immunlokalisering af proteinmål og hybridisering in situ af RNA ønskes, kan ovarier kan inkuberes med 80% acetone / H2O ved -20 ° C i 10 minutter i stedet for behandling med proteinase K.
    Proteinase K-behandling er udeladt til fremstilling af spytkirtlerne. Fortsæt direkte til trin 3,10.
  7. Umiddelbart dekanteres fordøjelse opløsningen ved forsigtig pipettering. Vaskes to gange, 5 minutter hver med iskold PBT at standse fordøjelsen.
  8. Udføre yderligere PBT vasker 2 ×, 5 minutter hver ved stuetemperatur.
  9. Post-rette på blødt væv fiksering opløsning ved stuetemperatur med nutation i 30 minutter. Post-fiksering trin ikke udføres for spytkirtlerne.
  10. Udfør PBT vasker 5 x, 5 min hver.

4. Hybridisering

  1. Dekanteres så Hyb / PBT som muligt. Tilsæt 1 ml af Hyb i hvert prøverør.
  2. Pak prøverøret i lukket luft beskyttende emballage (bobleplast) og sted inde i en hybridisering flaske. Forsegle flaske med en hybridisering flaskekapsel.
  3. Præ-hybridisering og hybridisering trin kan udføres let i en hybridiseringsovn. Udføre præ-hybridisering ved 55 ° C i 30 minutter med rotation.
  4. Tilstrækkelig tid til vævene for at sedimentere til bunden af ​​mikrofugerøret, idet Hyb er mere tæt end PBT. Dekanteres forsigtigt før hybridiseringsopløsningen. Væv kan blive gennemskinnelig og vanskelig at visualisere. Prøven kan reduceres ved at efterlade 50-100 gl opløsning volumen i hvert prøverør.
  5. Tilsættes 50 ul volumen af ​​Hyb i prøverør og opretholde i en varmeblok ved 55 ° C.
  6. Denaturere RNA-proben ved 85 ° C i 5-10 min. Umiddelbart, placeres denatureret probe på is i 5 min.
  7. Pipettere RNA-proben i prøverøret. RNA-proben vil flyde på overfladen af ​​Hyb. Bland ved at tænde røret forsigtigt.
  8. Udføre hybridisering i et totalt volumen på 50-100 pi Hyb per prøve. Inkuber prøverne i en fast mikrofuge tandstang i en hybridiseringsovn, eller i et flydende mikrofugerør tandstangen i et vandbad ved 55 ° C i 16-24 timer.

5. RNAse A Behandling

  1. Fjerne Hyb indeholder proben. Det er vigtigt at fastholde prøverne ved 55 ° C under vasketrinene at reducere ikke-specifik binding af resterende ubundne probe. Hvis flere prøver hybridiseret, anbefales det at holde prøveglas i en varmehærdet blok ved 55 ° C for at opretholde hybridisering temperatur i vasketrin.
  2. Udfør en hurtig vask med Hyb ved pipettering af 1 ml af opløsningen i mikrocentrifugen karrete og vende prøverøret 5-6 gange.
    Alle efterfølgende hurtige vaske i protokollen udføres på samme måde ved at tilsætte den ønskede opløsning og inverterende prøverøret flere gange.
  3. Udføre to yderligere vaske med Hyb ved 55 ° C, 30 min hver med rotation i hybridiseringen ovnen.
  4. Ækvilibrere i PBT ved inkubering ved stuetemperatur med Hyb / PBT (1:1) i 15 minutter med nutation.
  5. Udfør PBT vasker 5 x, 5 min hver.
  6. Fremstil frisk RNAse A buffer. Udføre RNAse A behandling af inkubering i 20 ug / ml RNAse A / PBT ved 37 ° C i 30 min. RNAse A spalter enkeltstrengede RNA og vil resultere i nedbrydning af uhybridiseret RNA-probe.
  7. Dekanteres RNAse en buffer og udføre en hurtig vask med PBT.
  8. Udfør PBT vasker 3 ×, 5 min hver.

6. Antistof Inkubation

  1. Fremstil frisk blokerende opløsning (5% kylling serum / 1% Western blokerende reagens / PBT) og blok prøver af inkubatorerrer i 1 ml opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur med nutation.
  2. Tilsættes 200 pi af en 1:1000 fortynding af anti-DIG-alkalisk phosphatase (AP)-konjugeret antistof i blokeringsopløsning. Inkuber ved 4 ° C natten over med nutation.

7. Alkalisk phosphatase Farvning

  1. Fjerne antistoffet og blokerende opløsning.
  2. Udfør en hurtig vask med PBT.
  3. Udfør yderligere PBT vasker 5 x, 10 min hver. Alternativt kan prøverne vaskes 3x 10 min hver, efterfulgt af en forlænget vask ved 4 ° C natten over med nutation.
  4. Fremstil frisk AP farvningsbuffer.
  5. Udfør hurtig vask med AP farvning buffer.
  6. Udfør yderligere vask med AP farvningsbuffer 3 ×, 5 min hver med nutationen.
  7. Forberede ifølge producentens anvisninger, frisk AP farvning opløsning indeholdende AP substratet NBT / BCIP.
  8. Inkuber hver prøve med 500 ul AP farvningsopløsning ved stuetemperatur temperature med nutationen, i mørke. Prøverne kan inkuberes ved at dække rørene med en uigennemsigtig beholder eller aluminiumfolie. Reaktion progression skal kontrolleres hver 1-2 minutter til dannelsen af ​​et lilla bundfald. Afhængigt af proben koncentration, koncentration af mål-RNA og tilstedeværelsen af ​​ikke-specifikke mål, kan farvning forløbe i adskillige minutter til adskillige timer.
  9. Fjerne så meget af farveopløsning som muligt. Utilfredsstillende dekantering resulterer i dannelsen af ​​et hvidt flokkulent præcipitat under efterfølgende vasketrin.
  10. Farvningen standses fuldstændigt ved at udføre to hurtige skylninger med PBT.
  11. Udfør yderligere PBT vasker 3 ×, 5 min hver.

8. Glycerol Montering

  1. Ved anvendelse af en stor boring 200 ul pipettespids, overføre prøver fra mikrocentrifugerør i individuelle rundbundede brønde i en Pyrex plet plade.
  2. Forsigtigt fjernes fra prøven så meget af PBT som muligt.
  3. Pipette oven på prøven 70% glycerol / H2O Tillader glycerol trænge prøven vævet ved 4 ° C natten over. Glycerol behandling forhindrer udtørring af væv under Montagepladen.
  4. Forbered objektglas ved at tørre slide overfladen ren med Kimwipes. Anvendelse på objektglasset to stykker usynlige tape parallelt med hinanden så de danner en smal kanal (figur 2).
  5. Ved hjælp af en kunstnerisk pensel opsamle prøver én efter én og placere dem langs længden af ​​kanalen, placerer hver prøve med den samme orientering i forhold til anteriore / posteriore og dorsal / ventral alignments.
  6. Efter positionering hver prøve ved at bruge en Kimwipe vatpind til at absorbere overskydende glycerol-opløsning omgiver væv (figur 3). Fjernelse af overskydende glycerol er vigtigt at forhindre dannelsen af ​​bobler, når forsegler monteret prøverne på objektglasset under et dækglas.
  7. Center og sted omhyggeligt aci slip på kanalen med den linie prøver. Fastgør dækslet glide semipermanently på dias ved at duppe hjørnerne af dækglasset med gennemsigtig neglelak.
  8. Anvendelse af en 200 gl pipette, dispensere langsomt i den ene ende af kanalen tilstrækkeligt 70% glycerol for at fylde ved kapillarvirkning hele rummet i kanalen og arealet under dækglasset.
  9. Permanent forsegle monterede prøver ved at anvende neglelak langs alle fire sider af dækglasset. Lad neglelak til at tørre tilstrækkeligt, før fotografering af de hybridiserede hel-mount væv. Det anbefales, at fotografere billeder af prøverne umiddelbart efter montering.

B. Hybridisering in situ i Mosquito embryoer

Opløsninger og buffere, der kræves for hybridisering in situ for myg embryoer er beskrevet (tabel 1). Fiksering og hybridisering procedurer, der præsenteres her, er blevet ændret fra Those først rapporteret for Anopheles gambiae, 5,6 Aedes aegypti 7 og Culex quinquefasciatus. 8

1. Embryonindsamlings

  1. Embryoer opsamles fra 300 parrede kvindelige voksne myg (lov til at parre sig med hanner i 48 timer, 3 dage efter fremspiring) 72 timer efter blod fodring. Myggene holdes på 3 M saccharoseopløsning, for at forhindre æglægning før den tilsigtede opsamlingsperiode.
  2. Forbered embryonindsamlingsteam beholdere ved foring af en 16 ounce papir kop med Saatilene HiTech mesh, således at den indvendige overflade af skålen dækkes helt. Masken kan fastgøres ved hjælp af en enkelt hæfteklamme. Anvendelse af denne mesh reducerer fibrøse stoffer, der er til stede, hvis Whatman filtrerpapir, eller papirhåndklæder anvendes.
  3. Fylde beholderen halvfuld med destilleret vand.
  4. Embryoer opsamles i 1 time ved anbringelse af opsamlingsbeholderen i buret, som efterfølgende dækkesaf en mørk klud til at stimulere æglægning.
  5. Embryoner indsamlet får lov til at modne til ønskede udviklingstrin uden for buret i standard opdrætsforhold (85% relativ fugtighed / 26 ° C). Modning af embryoer til forskellige stadier kan korreleres til tid (timer post-æglægning) efter den omtrentlige udviklingsmæssige tidsforløbet for embryonale beskrevne begivenheder (tabel 2). Denne tabel opsummerer de vigtigste begivenheder i fosterudviklingen for Aedes aegypti, rapporteret af Raminani og Cupp, beskrev 9,10 Anopheles gambiae først ved Ivanova-Kazas 11 og yderligere uddybet af Goltsev og kolleger, 12,13 og Culex quinquefasciatus rapporteret af Davis. 14 af tid, der er beskrevet kurser har til formål at tjene som første skøn, snarere end absolutte tidspunkter, til indsamling af embryoner på bestemte stadier af udvikling.

2. Dechorionation, fiksering og Endochoripå Forstyrrelse

  1. Overfør embryoer fra opsamlingsbeholderen til en Saatilene mesh dechorionation fangst rør (fig. 3).
    For Aedes embryoer, anbringes fangst røret i et bæger, der er fyldt med tilstrækkeligt med destilleret vand, således at volumenet af fangsten røret er en halvt fuld. En kunstnerisk Børsten kan anvendes til at fjerne embryonerne fra Saatilene mesh og overføre dem i vandfyldte fangst rør.
    For Anopheles embryoner, frigøre Saatilene maske fra opsamlingsbeholderen og folde mesh omhyggeligt for at danne en tragt. Holde nettet tragten med den ene hånd, anvendes den anden side at dispensere destilleret vand gennem et polyethylenrør sprøjteflaske langs siderne af tragten for at vaske embryoner i fangsten røret. Denne fremgangsmåde kan anvendes til Anopheles embryoer, fordi de mangler det klæbende stof på overfladen af Aedes embryoer, som gør det muligt æg til at klæbe til æglægning substrater.
  2. Prepare 40 ml dechorionation opløsning (1 volumen 5,25% natriumhypochlorit: 3 volumener af destilleret vand). Hældes opløsningen i en 100 mm petriskål.
  3. Forbered et 100 ml bægerglas indeholdende 50 ml destilleret vand, og der er afsat. Den dechorionation trin er tidsfølsomme, og umiddelbart efterfølgende natriumhypochlorit behandling embryonerne vil blive nedsænket i vandet, for at fortynde dechorionation opløsningen.
  4. Dechorionate embryonerne i maske fange røret ved at anbringe røret i petriskålen fyldt med dechorionation opløsning. Brug en engangs polyethylen overførsel pipette eller Pasteur pipette til at vaske de embryoner, mens hvirvlende fangsten hætteglasset, sådan at de befrugtede æg forbliver neddykket og rystet i dechorionation løsningen.
    Et maksimum på 35 sek kræves dechorionation af Aedes embryoer, mens 75 sek er tilstrækkelig til Anopheles og Culex embryoer (tabel 3). Dechorionation er en af ​​de mest følsomme trin i protocol og over-forlængelse af natriumhypochlorit behandling, specielt for Aedes embryoner vil forhindre korrekt krakning af chorion.
  5. Umiddelbart nedsænkes fangsten hætteglasset i bægerglas, der indeholder vand.
  6. Vask den resterende dechorionation opløsning fra embryoer ved at fjerne låsen røret fra vandfyldte bægerglas og skylle de indre og ydre vægge af fangsten røret med destilleret vand fra en sprøjteflaske eller hane forsynet med rør.
  7. Dechorionation kan verificeres ved at visualisere embryoner med et dissektionsmikroskop ved lav forstørrelse. Dechorionated Aedes embryoer mangler net-lignende exochorion og kun den glatte og poleret overflade af det sorte endochorion ses for dechorionated Anopheles embryoer, er exochorionic flyderne og Ridge strukturer fraværende (fig. 4).
  8. Ved hjælp af en kunstnerisk pensel, dechorionated embryoer overføres til et scintillationshætteglas med 5 ml destilleret water (Figur 5-1). Hvis flere prøver er under udarbejdelse, opretholde de fangstmængder rør i vand for at forhindre udtørring af embryoner.
  9. Lad embryoer sedimentere til bunden af ​​scintillationsflaske og fjerne så meget vand fra beholderen som muligt.
  10. Tilsæt 5 ml heptan til scintillationshætteglas (fig. 5-2). Fjerne eventuelt resterende vand, der forbliver i scintillationshætteglas.
  11. Tilsættes i scintillationshætteglas 5 ml frisk fremstillede embryo fikseringsopløsning (tabel 1).
  12. Fastsætte embryoner i 30 minutter med inversion, således at de organiske og vandige faser blandes grundigt, men ikke kraftigt.
  13. Fjern fiksering løsning med en glas-Pasteur-pipette, og pas på ikke at forstyrre interfasen, som indeholder de embryoner (figur 5-3).
  14. Vask den tilbageværende binding opløsningen ved at fylde scintillationshætteglas med så meget vand som muligt. Vend hætteglasset 5 gange, ogderefter fjerne al destilleret vand.
  15. Fyld scintillationshætteglas med 20 ml destilleret vand og blandes ved at vende glasset i 30 minutter.
  16. Fjerne alt vandet fra scintillationshætteglas.
  17. Tilsættes tilstrækkeligt kogende destilleret vand i scintillationshætteglas, således at den uorganiske heptan fase når toppen af ​​hætteglasset.
  18. Inkuber i 30 sekunder og derefter fjerne alt det kogende vand.
  19. Tilsættes iskoldt destilleret vand, indtil det uorganiske fase når toppen af ​​hætteglasset. Inkuber hætteglasset i is i 10 min.
  20. Fjerne først de vandige og derefter organiske faser. Den heptan vises opakt på dette trin (fig. 5-4).
  21. Tilsættes 5 ml af ny heptan i hætteglasset. Fjern alle resterende vand fra hætteglasset.
  22. Tilsættes 5 ml methanol i hætteglasset. Hætteglasset 1-2 gange energisk, uden omrystning (figur 6). Hvis de uorganiske heptan og organiske methanol faser rystes kraftigt embryonerne will være ødelagt under endochorion brud. Det er værd at nævne, at vi har observeret variation i effektiviteten af endochorion forstyrrelser for forskellige stammer af Aedes aegypti embryoner.
  23. Inkuber ved stuetemperatur i 15-20 min. I denne fase, vil de to faser bliver uklar på grund af frigivelsen af blomme komponenter (figur 5-5).
  24. Fjern begge organiske og uorganiske faser og vask med methanol 3 gange for at fjerne alle resterende heptan.
  25. Embryoner kan opbevares i methanol ved -20 ° C i op til flere måneder.

3. Peeling

  1. Placere et stykke dobbeltklæbende toupee bånd i midten af ​​en 3 cm petriskål. Toupee tape anvendes, fordi klæbemidlet er stabil i nærvær af methanol og ethanol.
  2. Anvender en stor boring (ca. 3 mm diameter) 200 ul pipettespids, transfer embryoner fra methanol på dobbeltklæbende tape.
  3. Tillad 1-2 min for de befrugtede æg til at bosætte sig og adhførend til båndet overfladen.
  4. Dekanteres overskydende methanol og tillade overfladen tørre let i 1-2 min.
  5. Tilsæt 4 ml 95% (190 proof) ethanol i petriskålen.
  6. Pipetter 600 ul destilleret vand i ethanol og hvirvel at blande. Båndet bliver opak farve. Tilsætning af destilleret vand, vil bevirke, at båndet bliver klæbrige og immobilisere embryoner under afskrælning. Dette trin kan udelades, hvis det ønskes.
  7. Anvende en 27,5 gauge nål fastgjort til en 1 ml sprøjte cylinderen at skrælle den revnede endochorion (figur 7). Efter frigivelse af hvide embryo fra de sorte endochorion rester, overføre embryoner fra båndet til ethanol reservoir af petriskålen anvendelse af en fin spids kunstnerisk børste. Anvendelse af en 3 mm boring pipettespids, embryoerne overføre til en Ambion 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 500 ul 200 proof ethanol.
    De skrællede embryoner ikke bør forblive på båndet i en længere periode, fordi de kan klæbe prmanently til båndet.
  8. Udføre 2-3 hurtige vaske med 100% (200 proof) ethanol og opbevares embryoner i overpertentlig ethanol ved -20 ° C. Skrællede embryoer kan opbevares ved -20 ° C i nogle få måneder uden at påvirke morfologi eller den efterfølgende hybridiseringssignal.

4. Afklaring af Yolk

  1. Udfør en hurtig vask med 200 proof ethanol. Overpertentlig ethanol bør anvendes til alle efterfølgende vasketrin og til fremstilling af p-xylen æggeblomme præcisering opløsning.
  2. Udfør en ethanol vask, 5 min med nutationen.
  3. Inkuber i P-xylene/ethanol (9:1) ved stuetemperatur i 1-1,5 timer med nutation. Den xylen trin tillader tydeliggørelse af blommen masse for at forbedre signal-støjforholdet.
  4. Fjerne xylen-ethanol-opløsning og udfører to hurtige skylninger med ethanol.
  5. Udfør en ethanol vask, 5 min med nutationen.
  6. Udføre to hurtige skylninger med methanol, efterfulgt af en methanol vask, 5 min mednutationen.
  7. Ækvilibrere i 4% formaldehyd fiksering opløsning ved vask en gang med methanol / formaldehyd fiksering opløsning (1:1).

5. Fiksering og Hybridisering in situ

Fiksering og hybridisering in situ er identiske med dem beskrevet i protokollen afsnit A.

C. Repræsentative resultater

Hybridiseringen in situ protokollen beskrevet her, resulterer i farvede farvningsmønstre, der indikerer tilstedeværelse og lokalisering af målrettet mRNA. Det er vigtigt at understrege, at de relative niveauer af transkript overflod ikke kan bestemmes ved hybridisering in situ. Hybridiseringsresultater afhænger af den specifikke mRNA-probe anvendt til hybridisering proceduren, overflod af mål-mRNA i den hybridiserede væv, såvel som probe koncentration og hybridiseringstemperatur. Sammenligning af væv hybridiseret med antisense og tilsvarende sense mRNA sonder gøre det muligt at præcise fortolkning af farvede mønstre.

Hybridisering in situ af hele montere spytkirtler kvindelige Aedes aegypti med mRNA-prober, der er målrettet amylase1 (AAEL006719), D7s2 (AAEL006423) og D7L2 (AAEL006424) indikerer akkumulering af disse transkripter i proximal-laterale, distale lateral og distale laterale / mediale lapper, henholdsvis (figur 8). 1 hel-mount ovarier af tre myggearter blev hybridiseret med mRNA sonder, der specifikt er rettet mod de respektive ortologe afskrifter af Oskar (figur 9). 7,8 Hybridisering in situ af hele-mount embryoner af Ae. aegypti, An. gambiae og Cx. quinquefasciatus blev udført under anvendelse af antisense-RNA-prober rettet mod respektive myg Oskar ortologe transkripter (figur 10). 7,8

IGUR 1 "src =" / files/ftp_upload/3709/3709fig1.jpg "/>
Figur 1. Skematisk diagram af post-hybridisering montering set-up.

Figur 2
Figur 2. Fremstillinq af Kimwipe mop anvendes under prøve montering. En Kimwipe væv vrides tæt til frembringelse af en fin spids MOP til at absorbere overskydende montering medium fra prøverne og slide.

Figur 3
Figur 3. Skematisk Saatilene mesh dechorionation fangst rør. A) Bunden af en 50 ml polystyren konisk rør afskæres til dannelse af et hult rør 4,5 cm i længde, åben i begge ender. En cirkulær åbning er udskåret af den koniske rør låget for at tillade væske at blive vasket i en 6,5 cm 2 kvadratisk stykke Saatilene mesh. De 330 tråde per inch, 34 mikrometer i diameter tråd mesh fastholder de myg embryoner. B) Assembled fange rør.

Figur 4
Figur 4. Aedes aegypti og Anopheles gambiae æg, før og efter dechorionation. A) Aedes aegypti æg før dechorionation. Den netlignende exochorion ligger over den sorte endochorion og giver ægget en tekstureret udseende (indsat forstørrelse). Efter fjernelse af exochorion, er kun den glatte og polerede endochorion (B og indsat udvidelsen). C) Æg af Anopheles gambiae før dechorionation. Exochorion strukturer såsom flyderne er synlige (pile). D) Den glatte og polerede overflade af endochorion er synligt efter dechorionation. Bar = 100 um.

Figur 5
Figur 5. En serie af sekventielle trin til fiksering og endochorion forstyrrelse af Ae. aegypti æg. A) Skrå-frontbilledeog B) lateral-afbildning af scintillationsglas indeholdende Ae. aegypti æg i sekventielle trin i fiksering og endochorion forstyrrelser. 1) Embryoner i destilleret vand. 2) Embryoner flyde i interfasen mellem den øvre heptan fase og den nedre vandige fase. 3) Efter fiksering embryoner pakke sammen i en runde masse. Embryoer forbliver i interfasen mellem heptan og fikseringsopløsning faser. 4) Efter behandling med kogende vand og inkubering på is, bliver heptan fase svagt opaliserende. 5) Embryoner med desintegrerede endochorions er vist i interfasen mellem en uigennemsigtig heptan fase og transparent methanol fase.

Figur 6
Figur 6. Endochorion afbrydelse af fast Ae. aegypti æg. A) Umiddelbart efter energisk hvirvlende af heptan og methanol faser, kan dannelsen af ​​bobler og afbrydelse af endochorion visualiseres. B) following fem minutters inkubation ved stuetemperatur.

Figur 7
Figur 7. Mosquito æg følgende forstyrrelser og fjernelse af endochorion. Æg af Ae. aegypti (A), An. gambiae (B) og Cx. quinquefasciatus (C) efter fiksering og afbrydelse af endochorion. Hvide, gennemsigtige embryoner kan ses i revnet endochorion. Efter fjernelse af endochorion de gennemskinnelige embryoner fra Ae. aegypti (D), An. gambiae (E) og Cx. quinquefasciatus (F) er klart synlig. Bar = 100 um.

Figur 8
Figur 8. Hybridiseringer in situ for tre gener udtrykt i forskellige kamre af hel-mount, hun Ae. aegypti spytkirtler. Farvning er tegn på lokalisering og akkumulering af amylase1 (AAE L006719) (A), D7s2 (AAEL006423) (B) og D7L2 (AAEL006424) (B). Bar = 100 um.

Figur 9
Figur 9. Hybridisering in situ for myg Oskar antisense-RNA-prober til hel-mount myg oocyter og sygeplejerske celler. Stage IV oocyter (OOC) dissekeret fra ovarier af An. gambiae (A), Ae. aegypti (B) og Cx. quinquefasciatus (C) og hybridiseret med RNA-prober rettet respektive myg Oskar mRNA'er. Primære follikler er orienteret med anterior til venstre. Farvning på den bageste pol (blå pilespids) angiver akkumulerede Oskar mRNA. Sekundære (f2) og tertiære (F3) follikler er vist og farvning (sort pilespids) angiver akkumulering af Oskar mRNA i sygeplejersken cellecytoplasmaet (NCC). Farvning udelukket fra sygeplejersken cellekerner (NCN). Bar = 50 um.

ad/3709/3709fig10.jpg "/>
Figur 10. Hybridisering in situ for myg Oskar antisense-RNA-prober til hel-mount myg embryoner. Embryoer er orienteret med anterior til venstre. Cellular blastodermstadiet embryoner af An. gambiae (A) og Cx. quinquefasciatus (C) hybridiseres med respektive myg artsspecifikke Oskar RNA-prober. B) En syncytial blastodermstadiet Ae. aegypti embryo hybridiseres med RNA-prober rettet Ae. aegypti Oskar udskrift. Farvning er tydelig i den bageste pol cellerne i alle embryoer, hvilket indikerer lokalisering og akkumulering af myg Oskar mRNA i disse celler. Bar = 50 um.

Tabel 1
Tabel 1. Opløsninger og puffere for formaldehyd gelelektroforese, fiksering og hybridisering in situ.

ftp_upload/3709/3709table2.jpg "/>
Tabel 2 nedenfor. Developmental hændelser og morfologiske observationer svarende til på hinanden følgende trin under myg embryogenese.

Tabel 3
Tabel 3. Oversigt over de vigtigste forskelle i præ-hybridisering trin for forskellige vævstyper.

Discussion

Den hybridisering in situ og kolorimetriske farvningsprotokol præsenteres her for hel-mount myg væv og embryoner er en nyttig teknik til lokalisering af udskrifter inden for specifikke organer og celletyper. Disse procedurer er en forbedring i forhold til vores tidligere rapporterede metoder, både i strømline omfattende vasketrin og tilførsel af yderligere tekniske detaljer og reagens kilder.

I vores erfaring, at kolorimetrisk påvisning af hybridiseringssignaler overlegen i følsomhed og klarheden af ​​hybridiseringssignalet i forhold til fluorescens-baserede detektionssystemer. Desuden kolorimetrisk detektion omgår spørgsmål i forbindelse med signal forskelsbehandling i embryoner, der er iboende auto-fluorescerende. Begrænsninger detektering hybridiseringssignaler forekomme, når lav hyppighed transkripter er rettet, og baggrundsfarvning er indlysende. Forøgelse af hybridiseringshastigheden temperaturen til 65 ° C har vist sig at reducere tilbageformalede hybridiseringssignaler, men er ikke foreslået erstatning for udformning unikke målspecifikke RNA-prober.

Denne protokol er blevet anvendt til at udføre hybridisering in situ af hele monterede spytkirtler Aedes aegypti og ovarier og embryoner af Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti og Culex quinquefasciatus. Denne fremgangsmåde er også anvendelig til andre myg væv, og formodentlig de andre insekter. Desuden har vi samlet for første gang sammenlignende retningslinjer for iscenesættelsen af embryonale udvikling i tre vektor myg, Ae. aegypti, An. gambiae og Cx. fatigans. Observationer er blevet rapporteret for specifikke stammer af disse tre arter under diskrete opdrætsforhold. Det er vigtigt at bemærke, at udviklingsmæssige tidsforløbet kan variere for forskellige stammer af myggearter og under forskellige opdrætsforhold. Hybridiseringer in situ supplerer den igangværende bestræbelser på at analyze de transcriptomes af myg og andre leddyr, og kan give et bedre billede af reguleringen af ​​genekspression i disse organismer.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Marika Walters for at få råd til at udvikle hybridisering in situ metoder til blødt væv og Yury Goltsev for diskussion af protokoller for hybridisering in situ af Anopheles gambiae embryoner, som efterfølgende blev tilpasset og modificeret til at udvikle protokollen beskrevet her for hybridisering i situ Aedes og Culex embryoner. Vi anerkender også nyttige anbefalinger, Adam Paré og David Kosman. Vi takker Osvaldo Marinotti for videnskabelig diskussion og redigering af protokollen teksten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Ambion AM9261
1M Tris-HCl Ambion AM9855G pH8.0
10X PBS Ambion AM9625
20X SSC Ambion AM9763
1.5 ml microfuge tubes Ambion AM12400 Less opaque than standard tubes; aids in visualizing samples
Deionized formamide Ambion AM9342 Storage at 4 °C
DEPC water Ambion AM9932
Proteinase K Ambion AM2546
5.25% Sodium hypochlorite Austin’s A-1 Brand
T3 RNA Polymerase-Plus Ambion AM2733 Storage at -20 °C
T7 RNA Polymerase Ambion AM2082 Storage at -20 °C
95% Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Fisherbrand disposable polyethylene transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
37% Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
HPLC-grade methanol Fisher Scientific A452-1
Magnesium chloride Fisher Scientific M87-500
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-542A 18 x18 mm
N-Heptane Fisher Scientific H350-1
P-xylene Fisher Scientific O5082-500
Pyrex 9-well Spot Plate Fisher Scientific 13-748B 100x85 mm
Sodium chloride Fisher Scientific AC32730-0025
Sodium hydroxide Fisher Scientific SS255-1
Superfrost/Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 25x75x1.0 mm
Davlyn Red Clear-liner Toupee tape Hair Direct RED-75R12 Poly/Skin base material 0.75 in x 12 yd tape roll
TOPOTA Cloning Kit for Sequening with One Shot Top10 chemically-competent E. coli Invitrogen K457501 K457540 20 reactions
40 reactions
Sonicated salmon sperm DNA Invitrogen 15632-011 Storage at -20 °C
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments Roche Applied Science 1093274 Storage at 4 °C
DIG RNA labeling mix Roche Applied Science 1277073 Storage at -20 °C
NBT/BCIP stock solution Roche Applied Science 1681451 Storage at 4 °C
Western Blocking Reagent Roche Applied Science 11921673001 Storage at 4 °C
Saatilene Hitech polyester mesh (330.130) Saati Print 330.34 UO PW 330 threads/inch, 34 micron thread diameter, orange color
Glycerol Sigma G6279-1 70% in PBT
Heparin sodium salt Sigma H3393
Tween 20 Sigma P1379-500
37% Formaldehyde Ted Pella 18508 10 ml aliquots in amber ampoules
16 oz. Solo Paper containers with lids The Paper Company SOLOKH16AJ8000
Borosilicate glass scintillation vial with unattached screw cap VWR International 66022-128 20 ml case of 500
Sealed Air Bubble wrap celluar cushioning material VWR International 500018-081 10 foot/roll 0.188 inches thick
Chicken serum Whole blood was collected either from the wing vein or by cardiac puncture from a juvenile chicken. Blood was incubated at 37 °C for 1 h until coagulated and then placed on ice for 30 min. The serum was collected and centrifuged at 3000 x g for 10 min. The resulting supernatant (clarified serum) was collected and stored at -20 °C until use.
Table 4. Table of specific reagents and equipment for hybridization in situ.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Juhn, J. Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).
  2. Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes. J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).
  3. Benedict, M. Q. Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2. Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). (2007).
  4. Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual. Chapman & Hall. London. (1997).
  5. Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos. Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).
  6. Benedict, M. Q. Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7. Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). (2007).
  7. Juhn, J., James, A. A. oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).
  8. Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus. Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).
  9. Raminani, L. N., Cupp, E. W. Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Int. J. Insect Morphol. & Embryol. 4, 517-528 (1975).
  10. Raminani, L. N., Cupp, E. W. Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis. Int. J. Insect morphol. & Embryol. 7, 273-296 (1978).
  11. Ivanova-Kazas, O. M. Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg. Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).
  12. Goltsev, Y. Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo. Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).
  13. Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles. PLoS Biol. 9, e1000584 (2011).
  14. Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development. Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).
Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Af spytkirtler, æggestokke og embryoner af Vector Myg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Juhn, J., James, A. A. Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes. J. Vis. Exp. (64), e3709, doi:10.3791/3709 (2012).More

Juhn, J., James, A. A. Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes. J. Vis. Exp. (64), e3709, doi:10.3791/3709 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter