En steg för steg-protokollet för att isolera och identifiera RNA tillhörande komplex genom RIP-Chip.
Som en följd av utvecklingen av hög genomströmning sekvensering och effektiv microarray analys har den globala genuttrycksanalys bli ett enkelt och lättillgängligt form av datainsamling. I många forskning och modeller sjukdom emellertid inte steady state-nivåer av målgen-mRNA inte alltid direkt korrelerar med steady-state protein. Posttranskriptionell genreglering är en trolig förklaring till skillnaden mellan de två. Driven av bindningen av RNA-bindande proteiner (RBP), påverkar post-transkriptionell reglering mRNA-lokalisering, stabilitet och översättning genom att bilda en ribonukleoprotein (RNP)-komplex med mål-mRNA. Identifiera dessa okända de novo mRNA mål från cellulära extrakt i RNP komplexet är avgörande för att förstå mekanismer och funktioner hos RBP och deras resulterande effekt på protein utgång. Detta protokoll beskriver en metod kallad RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), som gör det möjligt att identifiera särskilda mRNA associerade i ribonukleoprotein komplexa, under föränderliga experimentella betingelser, tillsammans med alternativ för att ytterligare optimera ett experiment för den enskilde forskaren. Med detta viktiga experimentella verktyg kan forskarna undersöka de intrikata mekanismer associerade med posttranskriptionell genreglering samt andra interaktioner ribonukleoprotein.
På grund av att denna typ av experiment, optimering och erfarenhet kommer att vara de enda garanterade sätt att framgångsrikt förvärva de avsedda resultaten. I många steg i detta förfarande, temperatur och effektiv hantering av reagens och produkter är kritiskt viktiga. Ordentlig planering och genomförande av teknik kommer att bidra till att säkerställa att experimentet utfördes i en lämplig tidsram på de rekommenderade optimala temperaturer. En viktig fråga med RNA-isolering experiment är känsligheten hos RNA för nedbrytning av RNaser. Alla reagens måste vara RNas fri och lagras eller används i RNas-fria behållare. Detta är ett kritiskt steg för att säkerställa integriteten av din mRNA prov. Även när experimentet utförs korrekt, kan dock det önskade resultatet inte uppnås på grund av typen av interaktionen mellan RBP och dess mRNA mål.
Ett potentiellt problem är att ha låga eller ingen signal från RNA isolerades genom RIP-Chip.Även om det kan finnas signal från totalt RNA, kan detta vara ett resultat av otillräcklig bindande protein dras ned av pärlorna. Det första steget är att bekräfta att den cellulära lysatet som används har tillräcklig uttryck för specifika RBP. Efter bekräftelse, kan proteinet isoleras efter den slutliga tvättningen NT2 och återsuspenderades i Laemmli-buffert eller annat lämpligt denaturerande buffert och värmdes vid 95 ° C under 5 minuter. Western blot-analys kan användas på dessa prover i samarbete med indata lysat samt negativa kontroller för att säkerställa tillräcklig dra ner på tillhörande protein.
På grund lysering cellen krävs för att komma dessa komponenter, kan risken för onormala och oönskade interaktioner mellan normalt separerade proteiner och mRNA införas. Dessa interaktioner kan eventuellt binda och "suga upp" din målgrupp mRNA eller bindande proteiner genom ospecifika interaktioner. Dessutom proteiner i dessa varierande samarbetenditions kan vika i flera varianter och deras bindande motiv kan bli otillgängliga för sina mål mRNA, förebygga deras interaktioner. Båda dessa stärka vikten av att arbeta effektivt och att utnyttja de optimala temperaturerna anges för att begränsa dessa oönskade interaktioner. Dessutom kommer optimering av tvättbetingelser för varje specifikt målprotein vara kritisk för att maximera renheten av interaktionen. Mer stringenta tvättbetingelser kan behövas. Exempelvis kan tvättbufferten kompletteras med SDS eller en lämplig mängd urea för att minska ospecifika interaktioner och bakgrund i signalutmatning. Detta kommer att vara helt beroende av försöksledaren mål RBP samt mål-mRNA i de unika fysiologiska betingelser. Vissa villkor kommer inte att vara lämpliga för vissa verktyg mRNA analys, som bör observeras vid framställning av proverna.
Slutligen, även om RIP är framgångsrik i anrikning av RNA-RBP interaktioner en välkänd emission med RIP (CHIP) metod är oförmågan att identifiera de specifika domänerna av RBP på övergående mRNA mål. Flera tvärbindande tekniker kan användas, följt av RIP att isolera unika sekvenser mål, men tenderar användningen av kortvågigt UV att leda till nukleinsyra skador. En ny metod som kallas PAR-klipp eller fotoaktiverbara ribonukleosid tvärbindning och immuoprecipitation sysselsätter långvågig UV att införliva tiouridin i begynnande RNA möjliggör identifiering av unika bindningsställen från både stabila och övergående RNA interaktioner.
Sammantaget har RIP-Chip etablerats som ett utmärkt verktyg som används för att isolera och studera samspelet mellan RNA-bindande proteiner och deras mål mRNA av vår grupp, liksom många andra forskargrupper. Även känslig karaktär och praktiken kommer korrekt genomförande av detta förfarande ger isolering av dessa RNP komplex, som tills nyligen, har varit inaccessible för Discovery och analys.
The authors have nothing to disclose.
Department of Defense (Idea Award W81XWH-07-0406) – Till Ulus Atasoy
NIH RO1 A1080870 – Till Ulus Atasoy
NIH R21 A1079341 – Till Ulus Atasoy
University of Missouri institutionella fonder – Till Ulus Atasoy
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
1 M dithiothreitol | Fisher | BP172-5 | DTT |
DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
Ethylendiamine Tetraccetic Acid | Fisher | BP118-500 | EDTA |
Glycogen | Ambion | 9516 | |
1 HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
NT2 Buffer | *See Below | ||
Polysome Lysis Buffer | *See Below | ||
Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11873580001 | |
Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
RNase Out RNase inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-500 | SDS |
1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
Vanadyl Ribonucleoside Complexes | New England Labs | S1402S | VRC |
Reagent Workup |
Prepare reagents in RNase/DNase-free, DEPC-treated glassware |
Polysome lysis Buffer |
100 mM KCl |
5 mM MgCl2 |
10 mM HEPES (pH 7.0) |
0.5% NP40 |
1 mM DTT |
100 units/ml RNase Out |
400 μM VRC |
Protease inhibitor cocktail tablet |
5 ml of Polysome lysis buffer |
Add 50 μl of 1 M HEPES (pH 7.0) |
500 μl of 1 M KCL |
25 μl of 1 M MgCl2 |
25 μl of NP40 |
4.7 ml RNase-DNase-free H2O |
50 μl of 1 M DTT |
12.5 μl of 100 U/ml RNase Out |
200 μl Protease inhibitor cocktail (dissolved according to manufacturer) |
10 μl 200 mM VRC (at time of use) |
NT2 Buffer |
50 mM Tris-HCl (pH 7.4) |
150 mM NaCl |
1 mM MgCl2 |
0.05% NP40 |
1 L of NT2 Buffer |
50 ml Tris (pH 7.4) |
30 ml 5 M NaCl |
1 ml 1 M MgCl2 |
500 μl NP40 |
820 ml RNase-DNase-free H2O |