प्रतिगामी फ्लोरोसेंट लेबलिंग पहचाने गए न्यूरॉन्स से लक्षित कोशिकी एकल इकाई रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है<em> विवो में</em

Summary

फ्लोरोसेंट डाई के प्रतिगामी परिवहन शारीरिक प्रक्षेपण के आधार पर न्यूरॉन्स की एक उप जनसंख्या लेबल. लेबल एक्सोन नेत्रहीन को निशाना बनाया जा सकता है<em> Vivo में</em>, पहचान एक्सोन से कोशिकी रिकॉर्डिंग की अनुमति. इस तकनीक न्यूरॉन्स आनुवंशिक हेरफेर के माध्यम से लेबल या अलग करने के लिए मुश्किल हो जाता है नहीं किया जा सकता जब 'अंधा' का उपयोग कर रिकार्डिंग की सुविधा<em> Vivo में</em> दृष्टिकोण.

Abstract

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed ‘blind’, meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular¹, juxtacellular² or loose-patch³ iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology^4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons⁷, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult^8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.

The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals¹². We utilized this technique to study sensory processing by “small cells” in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. “Small cells” are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes¹³. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods^{11, 14}. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Protocol

1. डाई लिपटे सुई तैयार Electrolytically एक 160 माइक्रोन व्यास टंगस्टन तार 15 पैनापन. अंतिम सुई टिप व्यास 5-50 माइक्रोन से लेकर चाहिए. जरूरत सुइयों की संख्या क्षेत्र चिह्नित किया जा रहा के आकार पर निर्भर करता है. हम पीछे exterolateral नाभिक (ELP) में 3-5 इंजेक्शन के लिए 5 सुइयों तैयार. प्रयोग से पहले रात, प्रत्येक सुई के बाहर 100 मीटर पर 2 मिमी dextran संयुग्मित एलेक्सा Fluor 10,000 मेगावाट डाई की एक बूंद (<0.25 μl) जगह है. सुई नोक पर केंद्रित डाई छोड़ रहा है, कमरे के तापमान पर शुष्क हवा की अनुमति दें. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से बचाने के लिए एक अंधेरे कंटेनर में सुई स्टोर. 2. सर्जरी के लिए पशु को तैयार पानी के टैंक में 300 मिलीग्राम / एल एम एस -222 की एक समाधान में मछली रखकर सामान्य संज्ञाहरण प्रेरित. मछली और उपाय कांटा लंबाई (दुम फिन का कांटा करने थूथन की नोक) और शरीर गहराई (वजन dorso-ventra अधिक से अधिकअनुप्रस्थ विमान में एल दूरी). इन मापों मछली एक पानी विसर्जन खुर्दबीन उद्देश्य (चित्रा 1) के तहत जगह काफी छोटे से एक रिकॉर्डिंग कक्ष के अंदर फिट बैठता है ताकि तालिका 1 में संकेत दिया सीमाओं के भीतर गिर चाहिए. स्थिर और विद्युत पृष्ठीय शरीर मांसलता में 3 मिलीग्राम / एमएल flaxedil के 100 μl इंजेक्शन द्वारा मछली चुप्पी. टैंक पानी के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष (चित्रा 1 ए) भरें. कक्ष के केन्द्र (चित्रा 1) में मंच पर मछली उदर साइड नीचे रखें. मछली के मुंह में रखा एक विंदुक टिप (1-2 मिलीग्राम / मिनट) का उपयोग कर 100 मिलीग्राम / एल एम एस -222 की एक वातित समाधान उद्धार. शरीर (चित्रा 1C) के दोनों किनारों पर रखा मोम में तय की छड़ के साथ मछली स्थिर. नेत्र वाहिकाओं में लगातार रक्त प्रवाह और एक सामान्य शरीर के रंग के लिए जाँच करके मछली के स्वास्थ्य की निगरानी करें. अपने लंबे अक्ष के साथ मंच घुमाएँ और platf के पीछे के अंत कममछली के शरीर के बाकी जलमग्न रहता है, जबकि मछली के सिर के पृष्ठीय सतह के एक तरफ पानी के ऊपर सामने आ रहा है कि इतनी ORM. Kimwipe का एक छोटा सा टुकड़ा सुखाने को रोकने के लिए त्वचा की किसी भी गैर डूबे हुए हिस्से पर रखा जाना चाहिए. 3. सर्जरी (चित्रा 2) यहाँ वर्णित बुनियादी शल्य प्रक्रिया अच्छी तरह से स्थापित और मज़बूती से mormyrids 16 में vivo रिकॉर्डिंग में नेत्रहीनों के लिए प्रयोग किया जाता है. अन्य अनुप्रयोगों के लिए, लेबलिंग और रिकॉर्डिंग के लिए वांछित क्षेत्रों का पर्दाफाश. ब्याज की कोशिकाओं के अक्षतंतु टर्मिनलों युक्त क्षेत्र एक रंग में लिपटे सुई द्वारा पहुँच से बाहर होना चाहिए. उन्हीं axons की अधिक समीपस्थ क्षेत्रों युक्त क्षेत्र पानी विसर्जन लेंस (हमारे मामले में 2 मिमी) का काम दूरी को समायोजित करने के लिए ऊतक ऊपर पर्याप्त स्थान होना चाहिए. एक क्यू की नोक का उपयोग कर सिर के उजागर सतह को lidocaine के एक 0.4% समाधान लागू करें. एक स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, त्वचा का एक आयताकार टुकड़ा की परिधि में कटौती. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग आयत निकालें. आयत के आकार मछली के आकार के साथ पैमाने पर होगा, लेकिन लगभग 3 मिमी एक 6.2 सेमी मछली (2A चित्रा) के लिए एक्स 5 मिमी होना चाहिए. आयत के पार्श्व किनारे आँख के केंद्र के साथ तालमेल होना चाहिए, आयत के पूर्वकाल किनारे आंखों के लिए बस पीछे होना चाहिए, और आयत की औसत दर्जे किनारे मछली के midline की बस पार्श्व होना चाहिए. एक अतिरिक्त 2.5 मिमी वर्ग गैर अतिव्यापी क्षेत्र (चित्रा 2 बी) का पर्दाफाश करने anteromedially उजागर खोपड़ी क्षेत्र का विस्तार. पूरी तरह से सतह (चित्रा -2) सूखे के लिए किसी भी अतिरिक्त ऊतक और Kimwipes और मजबूर हवा दूर परिमार्जन करने के लिए स्केलपेल ब्लेड का उपयोग खोपड़ी के उजागर सतह को साफ और शुष्क. सुपर गोंद का उपयोग कर अग्रमध्य उजागर खोपड़ी क्षेत्र के लिए गोंद एक धातु पोस्ट. गोंद (चित्रा 2 डी) पूरी तरह से सूखा है जब तक प्रतीक्षा करें. </ली> , एक 6.2 सेमी मछली के लिए लगभग 2 मिमी एक्स 4 मिमी खोपड़ी की एक आयत निकालें. आयत की परिधि पतली करने के लिए एक ~ 0.5 मिमी व्यास गेंद मिल कार्बाइड टिप के साथ एक दंत ड्रिल का प्रयोग करें. फिर, एक छुरी और संदंश का उपयोग, अंतर्निहित मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए दूर आयत की परिधि में कटौती और यह छील. अतिरिक्त ड्रिलिंग या छोटी कैंची से काटने पूरी तरह ईएल (चित्रा 2 ई) का पर्दाफाश करने के लिए आवश्यक हो सकता है. पेशी से खून बह रहा होता है, तो एक विद्युतदहनकर्म इकाई इस्तेमाल किया जा सकता है. ड्यूरा मेटर (रंजित) और पिया मेटर (स्पष्ट) वसंत कैंची का उपयोग या एक सुई दोनों दूर कट और संदंश की एक जोड़ी के साथ कटौती भागों को हटा दें. exterolateral नाभिक (ईएल) के पूर्वकाल और कूल्हों भागों, अब क्रमश: इला और ELP, (चित्रा 3) दिखाई दे रहे हैं. 4. ब्याज की axons की प्रतिगामी लेबलिंग Interes के axons युक्त लक्ष्य क्षेत्र के ऊपर एक रंग में लिपटे सुई (चरण 1 में बनाया) के साथ एक आपरेटर स्थित करेंहमारे मामले ELP में टी,. तेजी से ऊतकों में सुई लगभग 25 माइक्रोन डालें. सभी डाई बंद आ गया है, जब तक 15-30 सेकंड प्रतीक्षा करें, और तब सुई वापस लेना. डाई लक्ष्य क्षेत्र भर में वितरित किया जाता है तो एक अलग स्थान में हर एक को रखने की जरूरत है, के रूप में अतिरिक्त ताजा सुइयों के साथ दोहराएँ. हम तैयारी प्रति 3-5 सुइयों का इस्तेमाल किया. Hickman की घंटी समाधान के साथ गुहा से अतिरिक्त डाई कुल्ला. डाई तेज और परिवहन के लिए कम से कम 2 घंटे तक प्रतीक्षा करें. 5. ब्याज के axons के दृश्य एक ईमानदार, अचल चरण epifluorescent खुर्दबीन के उद्देश्य के नीचे, मछली के साथ, रिकॉर्डिंग कक्ष रखें. मछली के शरीर प्रकाश पैठ occludes के रूप में, सफेद और फ्लोरोसेंट दोनों प्रकाश स्रोतों ऊपर से आना चाहिए. खोपड़ी गुहा ऊपर एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत की सावधानी नियुक्ति संतोषजनक brightfield छवियों की अनुमति देता है. Epifluorescence देखने, प्रतिदीप्ति फिल्टर के लिएविनिर्देशों डाई का अवशोषण / उत्सर्जन स्पेक्ट्रम से मेल खाना चाहिए. ताजा टैंक पानी के लिए श्वसन स्विच और एक ही प्रवाह दर को बनाए रखने. उजागर मस्तिष्क गुहा में एक जमीन तार प्लेस और रिकॉर्डिंग headstage के जमीन (6.3 देखें) से कनेक्ट. पूंछ के आधार पर अगली रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी प्लेस और बिजली अंग मुक्ति आदेश (EODC) की निगरानी के लिए एक अंतर एम्पलीफायर और रिकॉर्डिंग डिवाइस (जैसे ऑडियो की निगरानी, ​​आस्टसीलस्कप, या कंप्यूटर) से कनेक्ट. मछली संज्ञाहरण से ठीक होने के बाद, EODC मछली की हालत का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. कम बढ़ाई देखी मस्तिष्क क्षेत्र का एक छोटा स्केच तैयार करें. केवल उच्च वृद्धि (चित्रा 3 डी) के तहत दिखाई लेबल axons की सटीक स्थान की पहचान करने के लिए स्थलों (मछली से मछली के लिए भिन्न हो सकते हैं) के रूप में प्रमुख रक्त वाहिकाओं को शामिल करें. डाई नियुक्ति की पुष्टि करें. प्रथम (उन्मुखीकरण के लिए brightfield रोशनी के साथ पूरे ऊतक देखने <stronछ> चित्रा 3). तब फ्लोरोसेंट रोशनी (3B चित्रा) के साथ देखते हैं. ELP फैलाना लेबलिंग (आंकड़े 3 बी और 3 सी) होगा. डाई के photodynamic और phototoxic प्रभाव को सीमित करने के लिए प्रतिदीप्ति उत्तेजना को छोटा करें. उच्च वृद्धि के तहत इला पता लगाने के लिए स्थलों के रूप में जहाजों का प्रयोग करें. सतह के पास एक लेबल अक्षतंतु लिए खोज करते हुए फ्लोरोसेंट रोशनी से रोशन. (चित्रा 4). 6. कोशिकी गतिविधि रिकार्ड 1 मिमी आयुध डिपो, रेशा के साथ 0.58 मिमी आईडी borosilicate केशिका कांच का उपयोग चूषण रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड खींचो. आदर्श टिप आकार हमारे मामले में 17 0.1-0.2 माइक्रोन है जो लक्ष्य एक्सोन के व्यास पर निर्भर करेगा. हमारे आवेदन के लिए, इलेक्ट्रोड टिप व्यास 1.5 थे ± 0.4 माइक्रोन (सीमा: 1.0-2.4 माइक्रोन) एक 5 मिमी लंबे, संकीर्ण टांग के साथ आसपास घनी पैक ऊतक चलते बिना लेबल एक्सोन दृष्टिकोण करने के क्रम में. चुनाव भरेंसाथ trodes Hickman की घंटी समाधान फ़िल्टर्ड. अंतिम टिप प्रतिरोध 45.2 ± MΩ 38.0 (: 16-155 MΩ रेंज) है. एक दबाव बंदरगाह के साथ एक इलेक्ट्रोड धारक में इलेक्ट्रोड रखें और एक जोड़तोड़ पर घुड़सवार एक एम्पलीफायर headstage से कनेक्ट. दबाव बंदरगाह से एक दबाव नापने का यंत्र और क्रमशः, दबाव की निगरानी और नियंत्रण के लिए एक सिरिंज में एक टी जंक्शन को समाप्त करने के लिए एक दबाव लाइन चलाएँ. एक एम्पलीफायर को headstage और एक एनालॉग से डिजिटल अधिग्रहण डिवाइस से कनेक्ट करें. इलेक्ट्रोड लाइन में 30 मिलीबार जावक दबाव के साथ, एक लेबल अक्षतंतु के बगल में एक इलेक्ट्रोड जगह है. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ interfaced एक कम रोशनी स्तर कैमरा पिपेट प्लेसमेंट कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. ऊतक सतह के निकट आरंभ और अक्षतंतु की ओर इलेक्ट्रोड अग्रिम. आप अक्षतंतु दृष्टिकोण, जावक दबाव अक्षतंतु की एक मामूली है, लेकिन ध्यान देने योग्य आंदोलन का कारण होना चाहिए. इलेक्ट्रोड अक्षतंतु, (चित्रा -4 ए, ऊपर) शक्तिशाली रिकॉर्ड करने के लिए अगले हैइलेक्ट्रोड में ial परीक्षण उत्तेजनाओं (हमारे मामले में, हम 20 एम वी / सेमी की एक तीव्रता से कम 100 मिसे monophasic सकारात्मक और नकारात्मक अनुप्रस्थ दालों का इस्तेमाल किया, चित्रा 1 ए) पेश करते हुए. एक बिजली के विरूपण साक्ष्य उचित रिकॉर्डिंग / उत्तेजना (चित्रा -4 ए, नीचे) की पुष्टि करता है, हालांकि कार्रवाई क्षमता, मनाया नहीं किया जाना चाहिए. इलेक्ट्रोड में जावक दबाव जारी है और उत्तेजना / रिकॉर्डिंग दोहराना. कार्रवाई क्षमता अभी भी (चित्रा 4 बी) मनाया नहीं किया जाना चाहिए. इलेक्ट्रोड और दोहराने उत्तेजना / रिकॉर्डिंग करने के लिए मामूली (125 ± 25 मिलीबार) चूषण लागू करें. कार्रवाई क्षमता अब उत्तेजना (चित्रा 4C) के जवाब में मनाया जाना चाहिए. सहज गतिविधि भी हो सकती है. कार्रवाई क्षमता नहीं मनाया जाता है, तो, सक्शन रिलीज थोड़ा दबाव के साथ इलेक्ट्रोड साफ है, फिर थोड़ा इलेक्ट्रोड चाल, और प्रयास चूषण. कार्रवाई क्षमता दिखाई दे रहे हैं एक बार, दबाव लाइन बंद करें. के रूप में प्रोत्साहित और रिकॉर्डवांछित. 7. समाप्ति और निपटान सभी वांछित रिकॉर्डिंग पूरे हो जाने पर EODC बंद कर दिया है जब तक, 100 मिलीग्राम / एल एम एस-222 के साथ श्वसन के लिए स्विच. कोई EODC कम से कम 10 मिनट के लिए पता लगाया जाना चाहिए. संस्थागत दिशा निर्देशों और अनुमोदित जानवरों की देखभाल प्रोटोकॉल के अनुसार मछली के निपटान के. 8. प्रतिनिधि परिणाम हमारे विशेष आवेदन के लिए, हम केंद्रीय संवेदी न्यूरॉन्स द्वारा कोडिंग प्रोत्साहन का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं. लेबल axons से सफल रिकॉर्डिंग संवेदी उत्तेजना के लिए 18 एकल इकाई प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण अनुमति देते हैं. चित्रा 5A रिकार्डिंग कक्ष के बाएँ और दाएँ दीवारों के अंदर पर स्थित द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड का उपयोग अनुप्रस्थ electrosensory उत्तेजना के द्वारा पैदा प्रतिनिधि कार्रवाई क्षमता को दर्शाता है. स्पाइक बार एक कील रेखापुंज साजिश (चित्रा 5 ब) के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है. एक 25 मिसे पूर्व उत्तेजना रिकॉर्डिंग हवाओउ सहज गतिविधि के निम्न स्तर को दर्शाता है. यह विशेष रूप से इला "छोटे सेल" लंबे समय से पारित प्रोत्साहन अवधि बढ़ जाती है (चित्रा 5C) के रूप में पुनरावृत्ति प्रति spikes की संख्या बढ़ रही है, 6 एम वी / सेमी की उत्तेजना तीव्रता पर प्रोत्साहन अवधि से परिचित है. मतलब पहली कील विलंबता 4.28 ± 0.16 मिसे, इला 11 में छोटे कोशिकाओं के लिए उम्मीद की विलंबता के साथ संगत है. चित्रा 1. एक निश्चित चरण epiflourescent खुर्दबीन के उद्देश्य के नीचे फिट कर सकते हैं कि एक रिकॉर्डिंग कक्ष के लिए निर्दिष्टीकरण. (ए) के पैमाने वर्ग रिकॉर्डिंग कक्ष ऊपर की ओर और वापस विचारों को प्रदर्शित plexiglass से बनाया है. परिधि पर उत्तेजक इलेक्ट्रोड (तारांकनों) की बनती सेट या तो अनुप्रस्थ (लाल काला) या अनुदैर्ध्य (नीले, पीले) उत्तेजना के लिए अनुमति देते हैं. केन्द्र (नारंगी) में एक रबर लाइन छेद के साथ कोने में Plexiglass के एक अतिरिक्त टुकड़ा,,एक निरंतर जल स्तर को बनाए रखता है कि एक सक्शन पिपेट रखती है. कक्ष (ठोस हरा) के तल में खराब दो खड़ी स्टेनलेस स्टील पदों समायोज्य डिस्क clamps के माध्यम से मछली (सी में विस्तृत प्रकाश ग्रे,) का समर्थन मंच से जुड़ी स्टेनलेस स्टील पदों (हरे रंग की रूपरेखा) से कनेक्ट. चैम्बर की एक तस्वीर के पैमाने पर ड्राइंग नीचे दिखाया गया है. (बी) के परिपत्र प्लास्टिक डिस्क clamps के व्यक्तिगत और इकट्ठे विचारों खड़ी पदों के लिए मंच को सुरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया. प्रत्येक डिस्क दबाना कस पेंच के लिए एक के बाद और एक केंद्र छेद के लिए एक नाली (हरा) है. खांचे एक दूसरे से सीधा कर रहे हैं, तो डिस्क clamps घुमाया जाता है. पेंच (लाल) clamps के मंच के आगे खड़ी और घूर्णी आंदोलन को रोकने के लिए जगह में पदों कस. जगह में मछली पकड़ इस्तेमाल plexiglass मंच की (सी) फ्रंट और साइड करने के लिए बड़े पैमाने पर देखा गया. मंच लकड़ी dowe रखती है कि पैराफिन मोम की एक परत (नीला) के साथ लेपित हैमछली का समर्थन करने के लिए जगह में रास (काली सलाखों). मछली respirating के लिए ट्यूबिंग मछली के मुंह में रखा एक विंदुक टिप में मंच और समाप्त होता है की 'चारपाई की अगली पीठ' में एक छेद के माध्यम से गुजरता है. एक स्टेनलेस स्टील के प्रधान पद (ग्रे पट्टी) 360 डिग्री रोटेशन की अनुमति एक गेंद संयुक्त के माध्यम से मंच को जोड़ता है. स्टेनलेस स्टील क्षैतिज पदों (हरा) मंच के दोनों छोर में खराब कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . चित्रा 2. सर्जरी के योजनाबद्ध सिंहावलोकन सिर के पृष्ठीय सतह पर नीचे देख रहे हैं. (ए) त्वचा की एक आयताकार टुकड़ा (लाल) को हटाने के लिए, आदेश में संकेत दिया, चार कटौती करें. (बी) anteromedially एक अतिरिक्त आयताकार टुकड़ा निकालने के लिए खोलने बढ़ाएँ त्वचा (हरा). (सी) से किसी भी शेष वसा या स्नायुबंधन बंद परिमार्जन कीतीर द्वारा संकेत और Kimwipes और मजबूर हवा के साथ पूरी तरह से सतह सूखी रूप स्केलपेल ब्लेड बढ़ रहा है. (डी) गोंद एक स्टेनलेस इस्पात के बाद सुपर गोंद का उपयोग कर खोपड़ी के लिए. एक में स्केल बार ई. के लिए लागू होता है. (ई) (क्रमशः इला और ELP,) पूर्वकाल और कूल्हों exterolateral नाभिक उजागर हड्डी (नीला) के एक आयताकार टुकड़ा दूर करने के लिए, आदेश में संकेत दिया, चार कटौती करने के लिए एक दंत ड्रिल का प्रयोग करें . बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . चित्रा 3. 3 घंटे dextran संयुग्मित एलेक्सा Fluor 568. (ए) पूर्वकाल और कूल्हों exterolateral नाभिक (इला और ELP, क्रमशः) के ऊपर से उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के साथ कल्पना के इंजेक्शन के बाद पीछे exterolateral नाभिक में फ्लोरोसेंट लेबलिंग. नोटइला के भीतर व्यापक myelination यह ELP से अलग है कि एक अपेक्षाकृत उज्ज्वल दिखाई देता है कि. (बी) एक ही क्षेत्र में एक TRITC फिल्टर के माध्यम से देखा epifluorescence का उपयोग कल्पना. (ग) एक मर्ज किए गए छवि के लिए नीले रंग का उपयोग करते हुए एक (brightfield) और बी के लिए लाल (TRITC). (डी) केवल उच्च वृद्धि के तहत दिखाई लेबल axons की सटीक स्थान (रक्त वाहिकाओं का सही स्थान की पहचान करने के लिए स्थलों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रमुख रक्त वाहिकाओं (लाल लाइनों) सहित इला और ELP का एक छोटा ड्राइंग का उदाहरण ) मछली से मछली को बदलता है. बिंदीदार रेखा इला और ELP के बीच सीमा को इंगित करता है. (ई) नमूना छवियों इला में छोटे सेल axons और SOMAS के सफल लेबलिंग पैटर्न की एक श्रृंखला illustrating 5 विभिन्न तैयारियों से एक TRITC फिल्टर का उपयोग कर प्राप्त कर लिया. 4 चित्रा. एकल इकाई कोशिकी रिकॉर्डिंगएक लेबल अक्षतंतु से. (ए) सकारात्मक दबाव में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (तीर सिर) इला में एक लेबल छोटे सेल अक्षतंतु से सटे रखा (ऊपर), monophasic एक 100 मिसे 20 एम वी / सेमी के जवाब में ही बढ़त विरूपण साक्ष्य (तीर सिर) रिकॉर्ड contralateral पॉजिटिव, अनुप्रस्थ वर्ग पल्स (नीचे). (बी) इलेक्ट्रोड से जावक दबाव (तीर सिर) का विमोचन इलेक्ट्रोड (ऊपर) की ओर से थोड़ा स्थानांतरित करने के लिए अक्षतंतु का कारण बनता है लेकिन प्रोत्साहन के लिए कोई प्रतिक्रिया (नीचे) अभी भी कर रहे हैं. ( सी) थोड़ा सा नकारात्मक दबाव इलेक्ट्रोड (ऊपर, तीर सिर) और उत्तेजना शुरुआत के जवाब में कार्रवाई क्षमता में अक्षतंतु खींचतान अब दिखाई दे रहे हैं (नीचे, तारांकन). सभी तीन पैनलों के नीचे भागों उत्तेजना के 20 repetitions के लिए मढ़ा प्रतिक्रिया कर रहे हैं. चित्रा 5. इस तकनीक का उपयोग प्रतिनिधि परिणाम है. (ए) 5 नमूना निशानmonophasic एक 0.1 मिसे 6 एम वी / सेमी द्वारा पैदा की कार्रवाई क्षमता दिखा, contralateral पॉजिटिव, अनुप्रस्थ वर्ग पल्स उत्तेजना. (बी) एक ही इकाई के लिए एक 75 मिसे रिकॉर्डिंग खिड़की के 20 repetitions के दौरान कील बार दिखा रेखापुंज साजिश 6 के साथ समय 0 पर उत्तेजित सही पर सूचीबद्ध durations के रेंज में एम वी / सेमी उत्तेजनाओं. (सी) अवधि ट्यूनिंग वक्र प्रोत्साहन पुनरावृत्ति प्रति spikes के रूप में रेखापुंज में प्रदर्शित प्रतिक्रियाओं बढ़ाता. मास (छ) कांटा लंबाई (सेमी) शरीर की गहराई (सेमी) माध्य 2.42 6.20 1.14 मानक विचलन 0.64 0.52 0.18 सीमा 1.2-4.0 5.5-8.4 0.9-1.6 तालिका 1. इष्टतमवजन, लंबाई और शरीर गहराई पर्वतमाला मछली के लिए. इष्टतम वजन, कांटा लंबाई (दुम फिन का कांटा करने के थूथन के टिप) और शरीर गहराई (अनुप्रस्थ विमान में अधिक से अधिक dorso-उदर दूरी) मछली में सचित्र रिकार्डिंग कक्ष में फिट करने के लिए अनुमति पर्वतमाला चित्रा 1. बहुत छोटे हैं कि मछली डाई नियुक्ति को चुनौती देने, जिससे सर्जरी के जीवित रहने के लिए और एक छोटे से ELP होगा कम होने की संभावना हो सकती है. बहुत बड़ी हैं कि मछली इला और ELP के लिए उपयोग कम हो जाएगा और इला और ELP पर ध्यान केंद्रित करने के लिए पर्याप्त उच्च शक्ति, जल विसर्जन उद्देश्य के कम रोक सकता है कि एक बड़े, अधिक पहुंचने सेरिबैलम होगा. आवेदन साइट डाई के प्रकार मछली का प्रयास इला में लेबल ELP में लेबल इकाइयों का प्रयास रिकॉर्डिंग ईएलएक एलेक्सा Fluor इंजेक्शन 32 26 (81.2%) 19 (59.4%) 50 4 (8.0%) इला एलेक्सा Fluor फिल्टर पेपर भिगो 1 0 0 0 0 इला DMSO में di-मैं 8 6 (75.0%) 0 0 0 इला डि हे क्रिस्टल 5 3 (60.0%) 2 (40.0%) 9 0 ELP ठोस एलेक्सा Fluor क्रिस्टल 2 0 2 (100%) 0 0 ELP एलेक्सा Fluor लेपित टंगस्टन तारों 43 <stronछ> 29 (67.4%) 41 (95.3%) 119 26 (21.8%) तालिका 2. प्रत्येक डाई इंजेक्शन विधि के लिए सफलता की दर. प्रत्येक डाई इंजेक्शन विधि के लिए सफलता की दर. तरीके इंजेक्शन साइट और डाई प्रकार के आधार पर विभाजित किया गया है. प्रत्येक विधि के लिए, मछली की कुल संख्या का प्रयास किया और इला और ELP में सफल लेबलिंग में हुई कि इन प्रयोगों का प्रतिशत दिखाया गया है. लक्षित रिकॉर्डिंग क्षेत्र आवेदन साइट (bolded बक्से) के विपरीत है कि ध्यान दें. इंजेक्शन साइट के लिए, डाई तेज SOMAS और axons दोनों की लेबलिंग के साथ सफल माना जाता था. इसके विपरीत, रिकॉर्डिंग साइट पर, लेबल axons के साथ ही तैयारी सफल लेबलिंग प्रयोगों के रूप में गिना गया. प्रयास की गई इकाइयों की कुल संख्या और सफल रिकॉर्डिंग में हुई कि इन इकाइयों का प्रतिशत भी दिखाए जाते हैं. # इंजेक्शन सी कीtes इंजेक्शन प्रति औसत मात्रा (μl) इंजेक्शन प्रति संस्करणों की श्रेणी (μl) औसत कुल इंजेक्शन की मात्रा (μl) कुल इंजेक्शन संस्करणों की श्रेणी (μl) हैमिल्टन के साथ microinjector 3 या 4 0.144 0.091-.91 0.516 0.378-0.669 कांच विंदुक के साथ Nanoinjector 2 – 4 0.069 (फिक्स्ड) निश्चित मात्रा 1-6 बार इंजेक्शन 0.621 0.414-0.966 कांच विंदुक के साथ microinjector 2-6 0.093 0.058-0.202 0.360 0.252-0.540 तालिका 3. डाई की मात्रा अल इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया तीन तरीकों में से प्रत्येक के लिए आवेदनइला (टेबल 2 से पहले विधि) में एलेक्सा Fluor इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया तीन तरीकों में से प्रत्येक के लिए लागू डाई का इला मात्रा में exa Fluor. इला में डाई इंजेक्शन या तो एक 33 गेज हैमिल्टन सिरिंज सुई या एक खींच लिया गिलास केशिका पिपेट का उपयोग कर एक nanoinjector और एक microinjector दोनों के साथ प्रदर्शन किया गया था. हम इंजेक्शन साइटों, इंजेक्शन प्रति मात्रा और डाई इंजेक्शन की कुल मात्रा का नंबर विविध.

Discussion

एक बार में महारत हासिल है, इस तकनीक का एक कई मॉडल प्रणाली में vivo रिकॉर्डिंग में लिए व्यक्ति एक्सोन सहित पहचान की न्यूरॉन्स, लक्षित करने के लिए अनुमति देगा. इसके अलावा, इस तकनीक का एक मज़बूती से चुनौती दे विवो रिकॉर्डिंग तरीकों में पारंपरिक बनाने अद्वितीय है कि संरचनात्मक विशेषताओं के साथ न्यूरॉन्स से कील उत्पादन में रिकार्ड करने की अनुमति देता है. हम mormyrid कमजोर बिजली मछली में इला "छोटे कोशिकाओं" से रिकॉर्ड करने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया है. "छोटे कोशिकाओं" की ट्यूनिंग गुणों का अध्ययन करने के लिए पिछले प्रयास चुनौतीपूर्ण रिकॉर्डिंग स्थितियों ^{11, 14} के कारण असफल रहे थे. इसी प्रकार की शारीरिक विशेषताओं के कई अलग अलग कशेरुकी श्रवण और electrosensory न्यूरॉन्स ^8-10 से एकल इकाई रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए बाधाओं को पैदा करते हैं. हमारी प्रणाली में इन चुनौतियों को दूर करने के लिए हम "छोटे कोशिकाओं है कि" इला में केवल कोशिकाओं रहे हैं कि इस तथ्य का फायदा उठाया ELP के लिए परियोजना. इस प्रकार, ELP में रखा डाई की प्रतिगामी परिवहन "छोटा करने के लिए इला में लेबलिंग की सीमासेल "SOMAS और axons. axons की फ्लोरोसेंट लेबलिंग दुर्गम SOMAS के बावजूद संभव पहचान कोशिकाओं से एकल इकाई रिकॉर्डिंग बनाने, लेबल एक्सोन के बगल में सटीक इलेक्ट्रोड नियुक्ति की अनुमति दी. हम आसपास के engulfing synapses, ¹¹ की वजह से शायद, दैहिक रिकॉर्डिंग का प्रयास किया, लेकिन असफल रहे थे ^{, 17.} हालांकि, दैहिक लेबलिंग स्पष्ट रूप से इस तकनीक को अन्य प्रकार की कोशिकाओं और अन्य सर्किट में दैहिक रिकॉर्डिंग लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता सुझाव है कि दिखाई दे रहा था. विवो में प्रतिगामी परिवहन के माध्यम से न्यूरॉन्स के फ्लोरोसेंट लेबलिंग विट्रो ^19-21 में लक्षित रिकॉर्डिंग मार्गदर्शन के लिए इस्तेमाल किया गया है . ऐसा ही एक तकनीक zebrafish के रीढ़ की हड्डी ²² में मोटर न्यूरॉन्स से vivo रिकॉर्डिंग में लक्षित के लिए इस्तेमाल किया गया था. हमारा काम लेबलिंग और रिकॉर्डिंग दोनों मस्तिष्क के भीतर विवो में किया जाता है, जिसमें इस दृष्टिकोण का एक उपन्यास विस्तार का प्रतिनिधित्व करता है. हमारा तरीका दर्शाता है कि vivo में एक प्रतिगामी टी के साथ सीएनएस क्षेत्रों की लेबलिंगदौड़ने इसी तरह चयनात्मक प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के साथ अन्य बरकरार सर्किट का अध्ययन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, स्तनधारी श्रवण प्रसंस्करण में, अवर colliculus (आईसी) कई rhombencephalic संरचनाओं ²³ से जानकारी के लिए एक महत्वपूर्ण रिले केंद्र के रूप में कार्य करता है. आईसी में डाई इंजेक्शन चुनिंदा इन नाभिक में से प्रत्येक से प्रक्षेपण कोशिकाओं लेबल होगा. बेहतर colliculus (एससी) दृष्टि ²⁴ के लिए इसी तरह के एक समारोह में कार्य करता है. रीढ़ की हड्डी की तैयारी विशेष रूप से अच्छी तरह से रीढ़ की हड्डी में आसानी से पहुंचा जा सकता है, के रूप में डाई इंजेक्शन अब तक रिकॉर्डिंग साइट से हो सकता है, इस तकनीक के लिए उपयुक्त हैं, और इसे और अधिक विस्तृत संरचनात्मक जानकारी ²⁵ प्राप्त करने के लिए चुनिंदा न्यूरॉन्स के intracellular रिकॉर्डिंग और भरने के साथ जोड़ा जा सकता है. अंत में, पथ अनुरेखण जटिल circuitry ²⁶ मैप करने के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में इस्तेमाल किया है एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है. हमारे विधि डब्ल्यू किया गया है के रूप में इन अध्ययनों के लिए कार्यात्मक जानकारी जोड़ने के लिए उपयोग किया जा सकता हैबिल्ली दृश्य प्रांतस्था ²⁷ में ith और कैल्शियम के प्रति संवेदनशील संकेतक.

अच्छी तरह से स्थापित है जो सर्जरी, विश्वसनीय, और नियमित रूप से विवो रिकॉर्डिंग ¹⁶ में नेत्रहीनों के लिए प्रयोग किया जाता है, कम से कम खून बह रहा है और पशु और जीवित रहने के लिए ऊतक अनुमति देने के लिए मस्तिष्क की सतह को कोई नुकसान के साथ पूरा किया जाना चाहिए. अभ्यास के साथ, सर्जरी और डाई आवेदन 30-45 मिनट में पूरा किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक तैयारी के 67% में "छोटे सेल" एक्सोन लेबल. हाल तैयारी केवल 1 या 2 दिखाई लेबल एक्सोन है, लेकिन कुछ के रूप में कई के रूप में 8 है. प्रयास किया 119 लेबल इकाइयों, हम 12 तैयारियाँ (तालिका 2) पर वितरित 26 इकाइयों से एकल इकाई रिकॉर्डिंग प्राप्त की. इस प्रकार, डेटा 28% की समग्र सफलता दर के लिए लेबल axons के साथ तैयारी की 41% से एकत्र किए गए थे.

डाई आवेदन के महत्वपूर्ण पहलू गहराई लेबलिंग है. टंगस्टन तार के उथले प्रविष्टि धोया ओ जा रहा डाई में परिणाम होगाप्र. पैठ बहुत गहरी है हालांकि, अगर लेबल एक्सोन को निशाना बनाने के लिए नहीं दिखाई देंगे. इसके अलावा, सेल करने के लिए कुछ यांत्रिक क्षति के लिए पर्याप्त रूप से ^{25, 28} के ऊपर उठाए जाने की डाई के लिए होने चाहिए. हालांकि, बहुत ज्यादा नुकसान कोशिकाओं को मार देंगे. हम ELP में लेबल एक्सोन (3 टेबल) से रिकॉर्डिंग के साथ रखा इला में डाई इंजेक्शन के माध्यम से अग्रगामी लेबलिंग सहित अन्य रंगों और अन्य तरीकों (तालिका 2) के साथ लेबलिंग का प्रयास किया. हम लेबलिंग उन्हें अनुत्तरदायी, जिससे शारीरिक क्षति के साथ कोशिकाओं के लिए सीमित था क्योंकि अग्रगामी लेबलिंग सफल नहीं था कि परिकल्पना है. इसके अतिरिक्त, पूर्व synaptic टर्मिनलों परेशान हो सकते हैं. इसके विपरीत, प्रतिगामी लेबलिंग इन चिंताओं की वजह से दोनों को कम करता है. राशि और डाई आवेदन की स्थिति का अध्ययन किया जा रहा है विशेष रूप से सर्किट के अनुसार संशोधित किया जा सकता है. अधिकतम लेबलिंग हम लेपित टंगस्टन तारों का प्रयोग कर प्राप्त है, जो सबसे बड़ी डाई एकाग्रता के साथ होता है. हालांकि, डी के साथ एक्सोन लेबलिंग के लिएयह उन्नत है के रूप में ep के अनुमानों, डाई एक टंगस्टन सुई बंद आ सकता है. इन मामलों में, दबाव इंजेक्शन अधिक उपयुक्त होगा. डाई तेज और परिवहन 2 घंटे के बाद इंजेक्शन और 6 घंटे के बाद इंजेक्शन के रूप में देर के रूप में प्रदर्शित होने के अतिरिक्त लेबल axons के रूप में जल्दी के रूप में दिखाई जा रही है हमारी तैयारी में लेबल axons के साथ, तेजी से कर रहे हैं. इस प्रकार, लेबलिंग और रिकॉर्डिंग अस्तित्व सर्जरी के साथ जुड़े तकनीकी कठिनाइयों को दूर करने, एक ही दिन में पूरा किया जा सकता है. समय डाई परिवहन के लिए आवश्यक दूरी के आधार पर प्रत्येक आवेदन के लिए अलग अलग होंगे.

एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू इलेक्ट्रोड स्थान है. यह टिप के clogging रोकने के लिए लेबल अक्षतंतु की साइट के लिए ऊतक करे प्रवेश करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसे इला में के रूप में घने ऊतक के लिए, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड पर एक लंबी, पतली टांग ऊतक आसपास से अधिक आंदोलन को कम करता है. एक सफल रिकॉर्डिंग एक रिकॉर्डिंग प्राप्त किया जाता है जब तक ताजा इलेक्ट्रोड के साथ पहला प्रयास, दोहराने पर हासिल की या tiss नहीं है, तोue अक्षतंतु अब नहीं दिख रहा है, जिस पर बात करने के लिए बाधित है. हालांकि, जल्दी विरंजन phototoxicity पैदा कर सकता है जो फ्लोरोसेंट जोखिम की राशि को कम करने के लिए और सेल ^29-31 के शारीरिक गुणों को प्रभावित कर सकता अक्षतंतु के बगल में इलेक्ट्रोड जगह के लिए भी महत्वपूर्ण है.

अक्षतंतु के एक खंड को सफलतापूर्वक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में suctioned है, एक बार रिकॉर्डिंग के कई घंटे के लिए प्राप्त किया जा सकता है. इकाइयों को लगातार कम से कम 1 घंटे में खो रहे हैं, बाहर होता जा रहा से अक्षतंतु को रोकने के लिए छोटे इलेक्ट्रोड युक्तियाँ बनाने पर विचार करें. दूसरी ओर, एक टिप का बहुत छोटा अक्षतंतु को clogging, कम संकेत करने वाली शोर, या नुकसान में परिणाम हो सकता है. कील आयाम और अतिरिक्त चूषण के साथ एक इकाई की 'वापसी' में लगातार कमी टिप बहुत बड़ी है कि एक संकेत है. बहुत ज्यादा मद्यपान अक्षतंतु को अपूरणीय क्षति हो सकती है. एक समाधान के लिए दबाव धीरे शून्य करने के लिए रिटर्न तो हवा लाइन में एक छोटी सी दरार की अनुमति है. तेजी वें equalizingई दबाव अक्षतंतु निष्कासित हो सकता है जो एक क्षणिक रिश्तेदार जावक 'पुश' में परिणाम होगा.

इस तकनीक की पहचान प्रक्षेपण न्यूरॉन्स से लक्षित रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए एक बड़ा लाभ का प्रतिनिधित्व करता है हालांकि डाई इंजेक्शन स्थल पर सभी प्रकार की कोशिकाओं द्वारा हाथ में लिया जाएगा, तब तक यह, स्थानीय interneurons भेद के लिए उपयोगी नहीं होगा. सैद्धांतिक रूप से, अलग इंजेक्शन साइटों के साथ कई fluorophores के उपयोग इस विधि का विस्तार करने की अनुमति दे सकता है. उदाहरण के लिए, एकल बनाम डबल लेबलिंग की तुलना सर्किट ³² में दो बिंदुओं पर दोहरी इंजेक्शन का पालन प्रक्षेपण न्यूरॉन्स से interneurons भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसी तरह, प्रतिगामी tracers ज़ेबरा चिड़िया उच्च गायन केंद्र (HVC) ³² में हाल ही में किया गया था के रूप में इस तरह के दो photon इमेजिंग के रूप में अन्य उन्नत इमेजिंग तकनीक के साथ जोड़ा जा सकता है. Epifluorescence सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करते समय भी, रिकॉर्डिंग क्षेत्रों हम केवल और 1 को हल करने में सक्षम थे, के रूप में सतह के पास उन लोगों के लिए सीमित कर रहे हैंम्यू, ऊतक के पहले 30 माइक्रोन के भीतर मीटर संरचनाओं. हालांकि, इस गहराई में इस तरह के दो photon माइक्रोस्कोपी ³³ या उद्देश्य मिलकर तलीय रोशनी माइक्रोस्कोपी के रूप में ³⁴ अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीक के प्रयोग के माध्यम से बढ़ाया जा सकता है. अपेक्षाकृत दुर्गम हैं कि उन सहित – यह मॉडल प्रणालियों की एक किस्म में कई अलग अलग सर्किट में एकल न्यूरॉन्स से रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि कुल मिलाकर, इस तकनीक vivo में तंत्रिका सर्किट के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Tricaine Methanesulfonate	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
Gallamine Triethiodide	Sigma-Aldrich	G8134	Flaxedil
Lidocaine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	L5647
Hickman’s Ringer Solution	NA	NA	NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)
Peristaltic Pump	Gilson or Rainin	Minipulse 3 Model 312; RP-1	10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter
Dissection Microscope	Nikon	SM2645
Super Glue	Super Glue Corporation	SGH2	2g tube
Omni Drill 35	World Precision Instruments	503-598
Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4	World Precision Instruments	501860	0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm)
Low Temp Cautery Kit	World Precision Instruments	500391
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Dextran Conjugated Alexa Fluor 568	Invitrogen	D-22912	2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings
Epifluorescent Microscope	Nikon	E600 FN	A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter – or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths
Low Power Objective	Nikon	93182	CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm
High Power Objective	Nikon	93148	CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm
White Light Source	Dolan-Jenner	Model 190	Fiber Optic Illuminator
Fluorescent Light Source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q
Low-light Level Camera	Photometrics	CoolSnap ES
Digital Manometer	Omega Engineering	HHP-201
Motorized Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Headstage	Molecular Devices	CV-7B	Axon Instruments
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	Axon Instruments
Data Acquisition System	Molecular Devices	Digidata 1322A	Axon Instruments
Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems	2100
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97	Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ‘0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament
Pipette Glass	World Precision Instruments	1B100F-4	Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID)