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Neuroscience

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen doi: 10.3791/3921 Published: June 26, 2013

Summary

Retrograden Transport von Fluoreszenzfarbstoff markiert eine Subpopulation von Neuronen auf anatomische Projektion basiert. Beschriftet Axone kann visuell ausgerichtet werden

Abstract

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Single-Unit-Antworten von einem identifizierten Population von Neuronen aufzuzeichnen. In vivo elektrophysiologischen Ableitungen von einzelnen Neuronen sind entscheidend für das Verständnis, wie neuronale Schaltkreise unter natürlichen Bedingungen funktionieren. Traditionell sind diese Aufnahmen durchgeführt "blind", dh die Identität des aufgenommenen Zelle am Anfang der Aufzeichnung bekannt. Cellular Identität kann nachträglich über intrazelluläre 1, 2 oder juxtacellular loose-Patch 3 Iontophorese des Farbstoffs bestimmt werden, aber diese Aufnahmen können nicht auf bestimmte Neuronen in Regionen mit funktionell heterogenen Zelltypen gezielt vorbehandelt werden. Fluoreszierende Proteine ​​können in einer Zelltyp-spezifischen Weise ermöglicht visuell geführten einzelligen Elektrophysiologie 4-6 ausgedrückt. Es gibt jedoch viele Modellsysteme für die diese genetischen Werkzeuge sind nicht verfügbar. Auch in genetisch zugänglich Modellsysteme, die gewünschte PROmoter unbekannt sein oder genetisch homogenen Neuronen haben unterschiedliche Muster Projektion. In ähnlicher Weise wurden virale Vektoren verwendet, um bestimmte Untergruppen von Projektionsneurone 7 bezeichnen, aber die Verwendung dieses Verfahrens ist durch die Toxizität und das Fehlen von trans-synaptischen Spezifität begrenzt. So werden zusätzliche Techniken, die spezifische Pre-Visualisierung bieten, um von einzelnen Neuronen identifiziert in vivo Aufnahme benötigt. Pre-Visualisierung der Zielneuron ist besonders für anspruchsvolle Aufnahmebedingungen für die klassischen Single-Cell-Aufnahmen sind oft prohibitiv schwierig 8-11. Die neue Technik in dieser Veröffentlichung beschrieben wird, verwendet retrograden Transport von einem fluoreszierenden Farbstoff aufgetragen wurde, mit Wolframnadeln schnell und selektive Markierung eine bestimmte Untergruppe von Zellen in einer bestimmten Region des Gehirns auf ihrer einzigartigen axonalen Prognosen, wodurch ein visueller Hinweis gezielt elektrophysiologischen erhalten von identifizierten Neuronen in einer intakten Schaltkreis withina Wirbeltiere CNS.

Der bedeutendste neue Entwicklung unserer Methode ist die Verwendung von Fluoreszenz-Markierung auf bestimmte Zelltypen nicht genetisch zugänglich Modell Zielsystem. Schwach elektrische Fische sind ein hervorragendes Modellsystem für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise in wach, sich verhaltenden Tier 12. Wir nutzten diese Technik, um sensorische Verarbeitung von "kleinen Zellen" in der vorderen exterolateral Kern (ELA) von schwach-elektrischen Fischen mormyrid studieren. "Kleine Zellen" sind die Hypothese zu Zeit Komparator Neuronen wichtig zum Erfassen submillisekundenschnelle Unterschiede in den Ankunftszeiten der präsynaptischen Spikes 13 sein. Allerdings haben anatomischen Merkmalen wie dichten Myelin Verschlingen Synapsen und kleine Zellkörper es extrem schwierig, aus diesen Zellen mit Hilfe von herkömmlichen Verfahren 11, 14 aufzunehmen. Hier zeigen wir, dass unser neues Verfahren selektiv markiert diese Zellen in 28% der Vorbereitungen, so dass für eine zuverlässige, robuste und Aufnahmen characterisierung der Antworten auf elektrosensorischen Stimulation.

Protocol

1. Bereiten Dye-beschichtete Nadeln

  1. Elektrolytisch schärfen eine 160 Mikrometer Durchmesser Wolframdraht 15. Finale Nadelspitze Durchmesser sollte 5-50 &mgr; m liegen. Die Anzahl der Nadeln ist abhängig von der Größe der Region markiert ist. Wir bereiteten 5 Nadeln für 3-5 Injektionen in den hinteren exterolateral Kern (ELP).
  2. Die Nacht vor dem Versuch, einen Tropfen (<0,25 ul) von 2 mM Dextran-konjugierten Alexa Fluor 10.000 MW Farbstoff auf den distalen 100 um jeder Nadel.
  3. Lassen Sie die Nadeln an der Luft bei Raumtemperatur trocknen, so konzentrierte Farbstoff an der Spitze. Bewahren Sie die Nadeln bei 4 ° C in einem dunklen Behälter, um sie vor Licht zu schützen.

2. Bereiten Tier für Chirurgie

  1. Induce Vollnarkose, indem Sie den Fisch in einer Lösung von 300 mg / L MS-222 in Tank Wasser.
  2. Wiegen Sie den Fisch und Maßnahme Gabellänge (Spitze des Mauls bis Gabel Schwanzflosse) Körper und Tiefe (maximal dorso-Ventral Abstand in der Querebene). Diese Messungen sollten innerhalb der Bereiche in Tabelle 1 angegeben, so dass der Fisch in einer Aufnahme Kammer klein genug, um unter einem Wasser-Immersions-Mikroskop-Objektiv (Abbildung 1) zu platzieren passt fallen.
  3. Unbeweglichkeitseffekt und elektrisch Schweigen der Fische durch die Injektion von 100 ul von 3 mg / ml flaxedil in die dorsale Körpermuskulatur.
  4. Füllen Sie die Aufnahme Kammer (Abbildung 1A) mit Tank Wasser. Den Fisch ventralen Seite nach unten auf die Plattform in der Mitte der Kammer (Abbildung 1). Liefern eines belüfteten Lösung von 100 mg / L MS-222 mit einer Pipettenspitze in des Fisches Mund gelegt (1-2 ml / min). Stabilisieren der Fisch mit Stangen in Wachs auf beiden Seiten des Körpers (1C) angeordnet ist fixiert. Überwachen des Fisches Gesundheit, indem Sie für die kontinuierliche Blutfluss in den Augengefäße und einem normalen Körper Farbe.
  5. Drehen der Plattform entlang seiner Längsachse und Absenken des hinteren Endes des Plattform so dass eine Seite der dorsalen Fläche des Fisches Kopf über dem Wasser ausgesetzt ist, während der Rest von dem Körper des Fisches bleibt eingetaucht. Ein kleines Stück Kimwipe sollte auf einem nicht-eingetauchten Teil der Haut zu verhindern, Trocknen gelegt werden.

3. Chirurgie (Abbildung 2)

Die grundlegende chirurgische hier beschriebene Vorgehensweise ist gut etabliert und zuverlässig für Blinde in vivo-Aufnahmen in Mormyriden 16 verwendet. Für andere Anwendungen, setzen Sie die gewünschten Regionen zur Kennzeichnung und Aufzeichnung. Die Region enthält Axonterminalen der Zellen von Interesse erreichbar sein muss durch einen Farbstoff beschichtete Nadel. Die Region, die mehr proximalen Segmente denselben Axone muss ausreichend Raum über dem Gewebe, um die Entfernung des Wasser-Immersionslinse (2 mm in unserem Fall) unterzubringen.

  1. Tragen Sie eine 0,4% ige Lösung von Lidocain auf die freigelegte Oberfläche des Kopfes mit einem Q-Tip.
  2. Mit einem Skalpell geschnitten den Umfang eines rechteckigen Stück Haut. Entfernen Sie das Rechteck mit einer Pinzette. Die Größe des Rechtecks ​​wird mit Fisch skalieren, sondern sollte etwa 3 mm x 5 mm für eine 6,2 cm Fisch (2A) sein. Die seitliche Kante des Rechtecks ​​mit dem Mittelpunkt des Auges anzupassen, sollte der vorderen Kante des Rechtecks ​​unmittelbar hinter dem Auge, und die mediale Kante des Rechtecks ​​sollte genau lateral des Fisches Mittellinie.
  3. Erweitern Sie den ausgesetzt Oberkopf anteromedial eine zusätzliche 2,5 mm im Quadrat nicht überlappenden Bereich (2B) freizulegen.
  4. Völlig klar und trocken die freigelegte Oberfläche des Schädels mit dem Skalpell zu kratzen entfernt überschüssiges Gewebe und Kimwipes und Druckluft, um die Oberfläche (Abbildung 2C) trocknen.
  5. Kleber ein Metall Post an die anteromedial ausgesetzt Oberkopf mit Super Glue. Warten Sie, bis der Kleber vollständig trocken ist (Abbildung 2D). Entfernen Sie ein Rechteck des Schädels, etwa 2 mm x 4 mm für eine 6,2 cm Fisch. Verwenden Sie eine zahnärztliche Bohrer mit einem Durchmesser von 0,5 mm ~ Kugelmühle Hartmetallspitze, um den Umfang des Rechtecks ​​zu verdünnen. Dann, mit einem Skalpell und Pinzette, schneiden Sie den Umfang des Rechtecks ​​und ziehen sie weg, um die zugrunde liegende Gehirn freizulegen. Weitere Bohrungen oder Schneiden mit einer kleinen Schere kann notwendig sein, vollständig freizulegen EL (2E). Wenn Muskeln Blutung auftritt, kann ein Elektrokauterisation Gerät verwendet werden.
  6. Schneiden Sie sowohl die Dura mater (pigmentiert) und der pia mater (klar) mit Feder Schere oder eine Nadel, und entfernen Sie die geschnittenen Teile mit einer Pinzette. Die vorderen und hinteren Abschnitte des exterolateral Kern (EL) sind nun sichtbar, ELa und ELP, bzw. (3A).

4. Retrograde Markierung von Axonen in der Nähe

  1. Positionieren Sie einen Manipulator mit einem Farbstoff beschichtet Nadel (hergestellt in Schritt 1) ​​über dem Zielbereich enthält Axone interest, in unserem Fall ELP.
  2. Rasch die Nadel ungefähr 25 um in das Gewebe. Warten Sie 15-30 Sekunden, bis der gesamte Farbstoff hat sich gelöst, und dann die Nadel zurückziehen.
  3. Wiederholen Sie mit zusätzlichen frischen Nadeln wie nötig, indem jedes in einem anderen Ort, so dass der Farbstoff in der Zielregion verteilt wird. Wir haben 3-5 Nadeln pro Vorbereitung.
  4. Spülen Sie überschüssige Farbe aus dem Hohlraum mit Hickman-Ringer-Lösung.
  5. Warten Sie mindestens 2 Stunden für Farbstoffaufnahme und Transport.

5. Visualisierung der Axone in der Nähe

  1. Legen Sie die Aufnahme Kammer, zusammen mit dem Fisch, unter dem Ziel von einer aufrechten, festen Bühne Epifluoreszenzmikroskop. Da der Körper des Fisches verschließt Lichteinfall, müssen beide weiß und fluoreszierende Lichtquellen von oben kommen. Sorgfältige Platzierung einer Faseroptik-Lichtquelle über dem Schädel Hohlraum ermöglicht zufriedenstellend Hellfeld Bilder. Für Epifluoreszenz Viewing, Fluoreszenz-FilterSpezifikationen sollte der Absorption / Emissionsspektrum des Farbstoffs.
  2. Schalten Atmung an die frische Tank Wasser und pflegen die gleiche Strömungsgeschwindigkeit. Legen Sie ein Erdungskabel in der exponierten Hohlraum im Gehirn und an den Boden der Aufnahme headstage (siehe 6.3).
  3. Setzen eines Paares von Aufzeichnungselektroden neben der Basis des Schwanzes und eine Verbindung zu einem Differenzverstärker und Aufnahmegerät (z. B. Audio, Oszilloskop, oder Computer), um das elektrische Organ Entladebefehlssignal (EODC) zu überwachen. Nach der Fisch wieder aus der Narkose kann die EODC als Indikator des Fisches Zustand verwendet werden.
  4. Bereiten Sie eine skalierte Skizze der Hirnregion bei niedriger Vergrößerung betrachtet. Fügen großen Blutgefäße als Landmarken (kann von Fisch zu Fisch unterschiedlich), um den genauen Standort von markierten Axone sichtbar nur unter hoher Vergrößerung (3D) zu identifizieren.
  5. Bestätigen Farbstoff Platzierung. Erster Blick gesamten Gewebes mit Hellfeld-Beleuchtung zur Orientierung ( (3B) zu sehen. ELP haben diffuse Kennzeichnung (3B und 3C). Minimieren Fluoreszenzanregung die photodynamische und phototoxische Wirkung des Farbstoffs zu begrenzen.
  6. Verwenden Sie die Gefäße als Landmarken zu ELa unter hoher Vergrößerung zu lokalisieren. Illuminate mit Fluoreszenzlicht bei der Suche nach einem markierten Axon nahe der Oberfläche. (Abbildung 4).

6. Notieren extrazelluläre Aktivität

  1. Ziehen Saug Aufnahme Elektroden unter Verwendung von 1 mm OD, 0,58 mm ID Borosilikatglas Kapillare Glas mit Faden. Ideal Spitze Größe hängt von dem Durchmesser der Ziel Axone, die in unserem Fall ist 0,1-0,2 um 17 ab. Für unsere Anwendung waren Elektrodenspitze Durchmesser 1,5 ± 0,4 um (Bereich: 1,0-2,4 um) mit einem 5 mm langen, schmalen Schaft, um markierte Axone ohne Bewegung des umgebenden Gewebes dicht gepackten nähern.
  2. Füllen elekElektroden mit gefiltertem Hickman-Ringer-Lösung. Letzter Tipp Widerstand beträgt 45,2 ± 38,0 MOhm (Bereich: 16 bis 155 MQ).
  3. Stellen Sie die Elektrode in einem Elektrodenhalter mit einem Druck-Port und verbinden Sie es mit einem Verstärker headstage auf einem Manipulator montiert. Ausführen einer Druckleitung von dem Druckanschluss zu einem T-Stück endet in einem Manometer und einer Spritze zum Überwachen und Steuern des Drucks auf.
  4. Verbinden der headstage an einen Verstärker und einen Analog-Digital-Erfassungseinrichtung.
  5. Mit 30 mbar Druck nach außen in der Elektrode Linie, legen eine Elektrode neben einer markierten Axon. Ein Low-Light-Level-Kamera eine Schnittstelle mit Imaging-Software wird verwendet, um die Platzierung Pipette zu visualisieren. Starten Sie in der Nähe der Oberfläche Gewebe und vor der Elektrode in Richtung Axon. Wie Sie das Axon zu nähern, sollte der Druck nach außen zu einer leichten, aber spürbaren Bewegung des Axon.
  6. Während die Elektrode neben dem Axon, (4A, oben) aufzeichnen potential an der Elektrode während der Präsentation Teststimuli (in unserem Fall haben wir 100 ms monophasische positive und negative Impulse quer bei einer Intensität von 20 mV / cm; 1A). Aktionspotentiale nicht beobachtet werden, obwohl eine elektrische Artefakt bestätigt korrekte Aufnahme / Stimulation (4A, unten).
  7. Lassen Sie den Druck nach außen in der Elektrode und wiederholen Stimulation / Aufnahme. Aktionspotentiale sollte noch nicht beobachtet werden (Fig. 4B) werden.
  8. Üben Sie einen leichten (125 ± 25 mbar) Absaugen der Elektrode und wiederholen Stimulation / Aufnahme. Aktionspotentiale sollte nun in Reaktion auf die Stimulation (4C) beobachtet werden. Spontane Aktivität können ebenfalls auftreten. Wenn Aktionspotentiale nicht eingehalten werden, lassen Sie die Saug-, deaktivieren Sie die Elektrode mit leichtem Druck bewegen die Elektrode leicht und versuchen erneut abgesaugt. Sobald Aktionspotenziale sichtbar sind, schließen Sie die Druckleitung.
  9. Stimulieren und notieren alsgewünscht.

7. Kündigung und Entsorgung

  1. Sobald alle gewünschten Aufnahmen abgeschlossen sind, um die Atmung zu wechseln mit 100 mg / L MS-222, bis die EODC gestoppt hat. Kein EODC sollte für mindestens 10 Minuten nachgewiesen werden.
  2. Entsorgen Sie die Fische nach den Richtlinien des Instituts und zugelassene Tierpflege Protokolle.

8. Repräsentative Ergebnisse

Für unsere spezielle Anwendung, wir sind interessiert an einem Studium Stimulus Codierung durch zentralen sensorischen Neuronen. Erfolgreiche Aufnahmen von markierten Axone die eine Analyse der Single-Unit-Reaktionen auf sensorische Stimulation 18. 5A zeigt repräsentative Aktionspotentialen durch transversale elektrosensorischen Stimulation mit bipolaren Elektroden, die auf den Innenseiten der linken und rechten Wänden der Aufnahme Kammer hervorgerufen. Spike mal als Spike Raster Grundstück (5B) vorgestellt werden. A 25 ms vor Stimulus Aufzeichnung Window zeigt das niedrige Niveau der spontanen Aktivität. Diese besondere ELa "kleine Zelle" ist lange vorbei, um Reiz Dauer bei einer Reizstärke von 6 mV / cm eingestellt, die Erhöhung der Anzahl der Spikes pro Wiederholung als Reizdauer zunimmt (5C). Der mittlere erste Dorn Latenzzeit 4,28 ± 0,16 ms, die der erwarteten Wartezeit für kleine Zellen in ELa 11.

Abbildung 1
Abbildung 1. Spezifikationen für eine Aufnahme Kammer, die unter dem Ziel einer festen Bühne epiflourescent Mikroskop passen. (A) Zu angelegte quadratische Aufnahme Kammer aus Plexiglas zeigt oben, seitlich und hinten gesehen hat. Gepaart Sätze von stimulierenden Elektroden (Sternchen) an der Peripherie entweder für Quer-(rot-schwarz) oder längs (blau-gelb) Stimulation zu ermöglichen. Ein zusätzliches Stück Plexiglas in der Ecke, mit einem gummierten Loch in der Mitte (orange),hält eine Saugpipette, die einen konstanten Wasserstand unterhält. Zwei vertikale Edelstahl Beiträge in den Boden der Kammer (grün) verschraubt Edelstahl Beiträge (grüne Umrandung), die an der Plattform, die die Fische (hellgrau, in C beschrieben) über verstellbare Scheibe Klemmen verbinden. Ein Foto von der Kammer unter dem to-scale Zeichnung dargestellt. (B) Individuelle und zusammengebaut Blick auf die kreisförmige Kunststoffscheibe Klemmen, um die Plattform, um den vertikalen Pfosten sichern verwendet. Jede Scheibe Klemme hat eine Nut (grün) für eine Stelle und ein zentrales Loch für die Befestigungsschraube. Disc Klemmen gedreht werden, so dass die Rillen senkrecht zueinander stehen. Anziehen der Schraube (rot) klemmt die Beiträge an Ort und Stelle zu verhindern, dass weitere vertikale und Drehbewegung der Plattform. (C) Front-und Seitenairbags to-scale Blick auf die Plexiglas-Plattform verwendet, um die Fische in Position zu halten. Die Plattform ist mit einer Schicht aus Paraffin (blau), die aus Holz dowe hält beschichtetls (schwarze Balken) an Ort und Stelle, um die Fische zu unterstützen. Schläuche zum Beatmen die Fische durch ein Loch in der "Kopfteil" der Plattform und endet in einer Pipettenspitze in des Fisches Mund gelegt. Ein Edelstahl-Kopf Beitrag (graue Balken) mit der Plattform über ein Kugelgelenk um 360-Grad-Drehung. Edelstahl horizontal Beiträge (grün) in jedem Ende der Plattform geschraubt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Operation nach unten auf der dorsalen Fläche des Kopfes. (A) Stellen Sie vier Schnitte, in der angegebenen Reihenfolge, um ein rechteckiges Stück Haut (rot) zu entfernen. (B) erweitern die Öffnung anteromedial eine zusätzliche rechteckiges Stück entfernen der Haut (grün). (C) abkratzen alle verbleibenden Fett oder Bänder durchBewegen des Skalpellklinge wie durch den Pfeil angedeutet und trocknen Sie die Oberfläche vollständig mit Kimwipes und Umluft. (D) Kleber ein Edelstahl-Beitrag auf den Schädel mit Super Glue. Maßstab in A gilt für AD. (E) mit einem Dentalbohrers bis vier Schnitte zu machen, in der angegebenen Reihenfolge, um ein rechteckiges Stück des Knochens (blau) zu entfernen, Freilegung der vorderen und hinteren exterolateral Kerne (ELA und ELP, respectively) . Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 3
Abbildung 3. Fluoreszenzmarkierung in der hinteren exterolateral Nucleus 3 Stunden nach der Injektion von Dextran-konjugierten Alexa Fluor 568. (A) Die vorderen und hinteren exterolateral Kerne (ELA und ELP, respectively) visualisiert mit Hellfeld-Beleuchtung von oben. Hinweisdass die umfangreichen myelination innerhalb ELa gibt es ein relativ helles Aussehen, das es von ELP. (B) Die gleiche Fläche mit Epifluoreszenz durch einen TRITC-Filter angesehen visualisiert. (C) Eine fusionierte Bild mit blau für A (Hellfeld) und rot für B (TRITC). (D) Beispiel eines skalierten Zeichnung ELa und ELP darunter große Blutgefäße (rote Linien), die als Landmarken verwendet werden, um die genaue Lage der markierten Axone sichtbar nur unter hoher Vergrößerung (die genaue Lage von Blutgefäßen identifizieren können variiert von Fisch zu Fisch). Die gestrichelte Linie zeigt die Grenze zwischen ELa und ELP. (E) Beispiel Bilder mit einem TRITC-Filter aus 5 verschiedenen Präparaten, die eine Reihe von erfolgreichen Muster der Kennzeichnung kleinzelligem Axonen und somas in ELa erworben.

Fig. 4
Abbildung 4. Einzel-Einheit extrazelluläre Aufnahmeaus einem markierten Axon. (A) Aufnahme-Elektrode (Pfeilspitze) unter Überdruck gesetzt neben einer markierten kleinzelligem Axon in ELa (oben) zeichnet nur Rand Artefakt (Pfeilspitzen) in Reaktion auf ein 100 ms 20 mV / cm monophasischen, kontralaterale-positive-, Quer-Rechteckimpuls (unten). (B) freigeben Druck nach außen von der Elektrode (Pfeilspitze) bewirkt, dass das Axon zu wenig bewegen in Richtung der Elektrode (oben), aber es gibt noch keine Reaktionen auf den Stimulus (unten). ( C) leichter Unterdruck zieht das Axon in die Elektrode (oben, Pfeilspitze) und Aktionspotentiale in Reaktion auf Stimulusbeginn sind nun sichtbar (unten, Stern). Untere Abschnitte aller drei Platten übereinander gelegt Antworten bis 20 Wiederholungen des Stimulus.

Abbildung 5
Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse mit dieser Technik. (A) 5 Probe Spurenzeigt Aktionspotentiale von einem 0,1 ms 6 mV / cm monophasische evozierte, kontralaterale-positive, quer Rechteckimpuls Reiz. (B) Raster Diagramm, Spike mal während 20 Wiederholungen einer 75 ms Aufnahme-Fenster für das gleiche Gerät zum Zeitpunkt 0 mit 6 stimuliert mV / cm Reize im Bereich von Laufzeiten auf der rechten Seite aufgelistet. (C) Dauer Stimmkurve Quantifizierung der Reaktionen im Raster als Spikes pro Reizwiederholrate angezeigt.

Gewicht (g) Gabel-Länge (cm) Karosserie Tiefe (cm)
Bedeuten 2,42 6,20 1,14
Standardabweichung 0,64 0,52 0,18
Reichweite 1,2-4,0 5,5-8,4 0,9-1,6

Tabelle 1. OptimalGewicht, Länge und Tiefe Körper reicht für die Fische. Optimale Gewichtsverteilung, Gabellänge (Spitze des Mauls bis Gabel Schwanzflosse) Körper und Tiefe (maximal dorso-ventralen Abstand in der Transversalebene) reicht damit Fische in der Aufnahme Kammer dargestellt in passen Abbildung 1. Fische, die zu klein sind, ist weniger wahrscheinlich, um die Operation zu überleben und einen kleinen ELP haben, so dass Farbstoff Platzierung herausfordernd. Fische, die zu groß sind, wird eine große, über weitreichende Kleinhirn, die Zugriff auf ELa und ELP reduzieren und kann verhindern, Senkung der hohen Strom-, Wasser-Immersions-Ziel nahe genug, um auf ELa und ELP konzentrieren.

Applikationsstelle Dye Typ Fisch versucht Label ELa Label ELP Einheiten versucht Recordings
ELa Alexa Fluor Injektion 32 26 (81,2%) 19 (59,4%) 50 4 (8,0%)
ELa Alexa Fluor getränkten Filterpapier 1 0 0 0 0
ELa Di-I in DMSO 8 6 (75,0%) 0 0 0
ELa Di-O-Kristallen 5 3 (60,0%) 2 (40,0%) 9 0
ELP Solide Alexa Fluor Kristalle 2 0 2 (100%) 0 0
ELP Alexa Fluor beschichtete Wolframdrähte 43 41 (95.3%) 119 26 (21,8%)

Tabelle 2. Die Erfolgsraten für jeden Farbstoff Injektionsverfahren. Erfolgsraten für jeden Farbstoff Injektionsverfahren. Methoden basieren auf der Injektionsstelle und Farbstoff-Typ unterteilt. Für jede Methode versucht die Gesamtzahl der Fische und der Anteil dieser Experimente, die in erfolgreichen Kennzeichnung in ELa und ELP Folge gezeigt. Beachten Sie, dass die gezielte Aufnahme Bereich das Gegenteil von dem Einsatzort (fett-Boxen) ist. Für die Injektionsstelle wurde Farbstoffaufnahme als erfolgreich mit Beschriftungsfeld beider somas und Axonen. Im Gegensatz dazu bei der Aufnahme vor Ort wurden nur Präparate mit markierten Axone als erfolgreich Markierungsexperimente gezählt. Die Gesamtzahl der versuchten Einheiten und der Anteil dieser Einheiten, die erfolgreich Aufnahmen geführt werden auch gezeigt.

# Der Einspritzung sites Durchschnittliches Volumen pro Injektion (ul) Bereich von Volumina pro Injektion (ul) Durchschnittliche insgesamt Injektionsvolumen (ul) Reichweite von insgesamt Injektionsvolumina (ul)
Microinjector mit Hamilton 3 oder 4 0.144 0,091 bis 0,91 0.516 0,378 bis 0,669
Nanoinjector mit Glaspipette 2-4 0.069 (fix) Feste injizierte Volumen 1-6 mal 0.621 0,414-0,966
Microinjector mit Glaspipette 2 - 6 0.093 0,058-0,202 0.360 0,252 bis 0,540

Tabelle 3. Die Mengen an Farbstoff für jedes der drei Verfahren verwendet werden, um Al injizieren angewendetexa Fluor in ELa Mengen an Farbstoff für jede der drei Methoden zur Alexa Fluor in ELa (Methode aus Tabelle 2) injiziert wird. Dye Injektion in ELa wurde sowohl mit einem nanoinjector und Mikroinjektor durchgeführt entweder mit einem 33 Gauge Hamilton Spritze Nadel oder ein gezapftes Kapillarpipette. Wir variiert die Anzahl der Injektionsstelle, das Volumen pro Injektion und das Gesamtvolumen der Farbstoff Injektion.

Discussion

Sobald beherrschen, wird diese Technik erlauben es, identifizierten Neuronen, einschließlich einzelner Axone, für die in vivo-Aufnahmen in vielen Modell Zielsysteme. Darüber hinaus ermöglicht diese Technik eine zuverlässig aufzeichnen Spike Ausgabe von Neuronen mit einzigartigen anatomischen Merkmale, die traditionell in vivo Aufnahme Methoden schwierig zu machen. Wir haben diese Technik genutzt werden, um aus ELa "kleinen Zellen" in mormyrid schwach elektrischen Fischen aufzunehmen. Frühere Versuche, die Stimmung Eigenschaften der "kleinen Zellen" zu studieren, waren erfolglos durch anspruchsvolle Aufnahmebedingungen 11, 14. Ähnliche anatomische Merkmale schaffen Hindernisse für den Erhalt von Single-Unit-Aufnahmen aus vielen verschiedenen Wirbeltieren auditorischen Neuronen und elektrosensorischen 8-10. Um diese Herausforderungen in unserem System zu überwinden, nutzten wir die Tatsache, dass "kleine Zellen" sind die einzigen Zellen in ELa dass Projekt ELP. Somit begrenzt retrograden Transport des Farbstoffes in ELP platziert Kennzeichnung in ELa zu "kleinencell "somas und Axonen. Fluoreszenzmarkierung der Axone erlaubt präzise Platzierung der Elektroden neben markierten Axone, so dass Single-Unit-Aufnahmen von identifizierten Zellen möglich trotz unzugänglich somas. Wir versuchten somatischen Aufnahmen, waren aber erfolglos, wahrscheinlich aufgrund der umliegenden verschlingenden Synapsen 11 , 17. war jedoch somatische Kennzeichnung deutlich sichtbar darauf hindeutet, dass diese Technik verwendet werden, um somatische Aufnahmen in anderen Zelltypen und andere Schaltungen abzuzielen. Fluoreszenzmarkierung von Neuronen durch retrograden Transport in vivo zur Führung gezielte Aufnahmen in vitro 19-21 verwendet wurde, . Eine ähnliche Technik wurde für die gezielte in vivo Aufnahmen von Motoneuronen im Rückenmark Zebrafisch 22 verwendet. Unsere Arbeit stellt eine neuartige Erweiterung dieses Ansatzes, in dem sowohl die Kennzeichnung und die Aufnahme in vivo im Gehirn sind fertig. Unsere Methode zeigt, dass in vivo Kennzeichnung von CNS Bereiche mit einer retrograden tRennfahrer können auf das Studium der anderen intakten Kreise mit ähnlich selektive Projektion Neuronen erweitert werden. Zum Beispiel in Säugetier-auditiven Verarbeitung dient der Colliculus inferior (IC) als wichtiger Weitergabezentrum für Eingänge von mehreren rhombencephalic Strukturen 23. Dye Injektion in den IC würde selektive Markierung der Zellen Vorsprung von jeder dieser Kerne. Der Colliculus superior (SC) bietet eine ähnliche Funktion für Vision 24. Rückenmark Zubereitungen eignen sich besonders gut für diese Technik geeignet, da das Rückenmark leicht zugänglich ist, Farbstoff-Injektion vom Aufnahmeort auftreten, und es kann mit intrazellulären Aufnahme und Füllen von ausgewählten Neuronen zu erwerben genauere anatomische Information 25 kombiniert werden. Schließlich ist Trakt-Tracing eine gut etablierte Technik in der zentralen Nervensystems verwendet werden, um komplexe Schaltung 26 zugeordnet. Unsere Methode kann genutzt werden, um funktionelle Informationen zu diesen Studien hinzufügen, wie hat w getan worden seinit Kalzium-sensitive Indikatoren in cat Sehrinde 27.

Die Operation, die gut etabliert ist, zuverlässig und regelmäßig für Blinde in vivo Aufnahmen 16 verwendet wird, muss mit minimalen Blutungen und keine Schäden an der Oberfläche des Gehirns, das Tier und das Gewebe zu überleben erlauben abgeschlossen sein. Mit etwas Übung kann die Chirurgie und Farbauftrag in 30-45 Minuten abgeschlossen sein. Wir haben erfolgreich "kleine Zelle" Axone in 67% der Präparate bezeichnet. Die meisten Präparate haben nur 1 oder 2 sichtbar markierte Axone, aber einige haben so viele wie 8. Von den 119 markierten Einheiten versuchten, erhielten wir Single-Unit-Aufnahmen aus 26 Einheiten über 12 Zubereitungen (Tabelle 2) verteilt. So wurden die Daten von 41% der Präparate mit markierten Axone für eine Erfolgsquote von 28% erhoben.

Der kritische Aspekt Farbauftrag wird die Kennzeichnung der Tiefe. Shallow Einsetzen der Wolframdraht in der Farbstoff gewaschen aw führenay. Wenn jedoch die Penetration zu tief, wird markiert Axone nicht sichtbar für das Targeting. Ferner muss eine mechanische Schädigung der Zelle für den Farbstoff ausreichend bis 25, 28 gemacht werden auftreten. Allerdings wird zu viel Schaden töten die Zellen. Wir haben versucht, die Markierung mit anderen Farbstoffen und andere Methoden (Tabelle 2), einschließlich anterograden Kennzeichnung durch Farbstoff Injektion in ELA mit Aufnahme von markierten Axone in ELP (Tabelle 3) gepaart. Wir vermuten, dass anterograden Kennzeichnung nicht erfolgreich war, weil Kennzeichnung wurde, um Zellen mit somatischen Schaden begrenzt, so dass sie nicht mehr reagiert. Zusätzlich kann präsynaptischen Terminals gestört worden. Dagegen minimiert retrograde Markierung beide dieser Probleme. Die Menge und Lage der Farbauftrag kann gemäß der speziellen Schaltung untersucht modifiziert werden. Maximal Kennzeichnung erfolgt mit dem größten Farbstoffkonzentration, die wir durch die Verwendung beschichteter Wolframdrähte. Allerdings, zur Beschriftung von Axonen mit deep Projektionen kann Farbstoff kommen aus einer Wolfram-Nadel, wie es fortgeschritten ist. In diesen Fällen würde Einspritzung besser geeignet. Dye Aufnahme und der Transport sind schnell, mit markierten Axone in unserer Vorbereitung sichtbar bereits 2 Stunden nach der Injektion und zusätzliche markierte Axone erscheinen so spät zu 6 Stunden nach der Injektion. Somit kann die Kennzeichnung und die Aufnahme an einem einzigen Tag durchgeführt werden, die Beseitigung technischer Schwierigkeiten mit dem Überleben Chirurgie. Die Zeitnahme erfolgt für jede Anwendung in Abhängigkeit vom Abstand zur Farbstofftransport erforderlich variieren.

Ein weiterer kritischer Aspekt ist die Platzierung der Elektroden. Es ist wichtig, um das Gewebe in der Nähe der Stelle des markierten Axon verhindern das Verstopfen der Spitze ein. Bei dichtem Gewebe wie in ELa minimiert ein langer, dünner Schaft auf der Aufzeichnungselektrode über Bewegung des umgebenden Gewebes. Wenn eine erfolgreiche Aufnahme nicht beim ersten Versuch wiederholen mit frischen Elektroden erreicht, bis eine Aufnahme erhalten oder die tissUE bis zu dem Punkt, an dem das Axon nicht mehr sichtbar beeinträchtigt. Es ist jedoch auch wichtig, schnell die Elektrode neben dem Axon, die Menge des fluoreszierenden Belichtung, die Phototoxizität verursachen können, zu minimieren und Bleichen können physiologische Eigenschaften der Zelle 29-31 beeinflussen.

Sobald ein Segment Axon erfolgreich in die Aufnahme-Elektrode abgesaugt, kann Aufnahmen für mehrere Stunden erhalten werden. Wenn Einheiten konsequent in weniger als 1 Stunde verloren gegangen sind, erwägen, kleinere Elektrode Tipps, um das Axon Herausrutschen zu verhindern. Auf der anderen Seite kann ein zu kleiner Spitze in Verstopfung, niedrigen Signal-zu-Rausch-, oder Schäden an der Axon führen. Ein stetiger Rückgang der Spitze Amplitude und der "Rückkehr" einer Einheit mit zusätzlicher Ansaug ist ein Indiz dafür, dass die Spitze zu groß ist. Zu viel Saug kann zu irreparablen Schäden an der Axon. Eine Lösung ist, ein kleines Leck in der Luftleitung ermöglicht so der Druck langsam auf Null zurück. Schnell Ausgleich the Druck wird in einem Übergangszustand relativ-außen "Push", die das Axon zu vertreiben führen kann.

Obwohl diese Technik, ein großer Vorteil für den Erhalt gezielte Aufnahmen von Projektion Neuronen identifiziert, wird es nicht zur Unterscheidung Interneuronen nützlich, als Farbstoff würde von allen Zelltypen an der Injektionsstelle entnommen werden. Theoretisch kann die Verwendung von mehreren Fluorophoren mit getrennten Injektionsstellen ermöglichen diese Verfahren erweitert werden. Zum Beispiel könnte Vergleich einzelner-versus Doppel-Markierung verwendet, um interneurons von Projektionsneurone nach Dual-Injektionen an zwei Punkten in der Schaltung 32 zu unterscheiden. Ebenso können retrograde Tracer mit anderen fortschrittlichen bildgebenden Verfahren, wie z. B. Zwei-Photonen-Imaging, wie kürzlich in Zebrafinken Hohe Vocal Center (HVC) 32 getan kombiniert werden. Außerdem sind die Aufnahme Regionen jenen nahe der Oberfläche begrenzt, wenn mit Epifluoreszenz Mikroskope, wie wir nur konnten 1 & lösenmu; m Strukturen innerhalb der ersten 30 um von Gewebe. Jedoch könnte diese Tiefe durch die Verwendung von anderen Mikroskopieverfahren wie Zweiphotonenmikroskopie 33 oder Ziel-gekoppelten planaren Beleuchtung Mikroskopie 34 verlängert werden. Insgesamt stellt diese Technik einen wichtigen Fortschritt bei der Untersuchung der neuronalen Schaltkreise in vivo, da sie verwendet werden, um von einzelnen Neuronen in vielen verschiedenen Schaltungen in einer Vielzahl von Modellsystemen aufnehmen - auch diejenigen, die schwer zugänglich sind.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Finanzierung bereitgestellt von der National Science Foundation (IOS-1050701 an BAC), die National Institutes of Health (NS54174 auf SM und F30DC0111907 zu AML-W.), Der Uehara Memorial Foundation und dem Japan-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften (G2205 zu TK ). Wir danken Julian Meeks für seine Unterstützung und Beratung zum Thema extrazellulären axonal Aufnahmen. Wir danken Carl Hopkins zur Bereitstellung eines Prototypen Aufnahme Kammer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine Methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 MS-222
Gallamine Triethiodide Sigma-Aldrich G8134 Flaxedil
Lidocaine Hydrochloride Sigma-Aldrich L5647  
Hickman’s Ringer Solution NA NA NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)
Peristaltic Pump Gilson or Rainin Minipulse 3 Model 312; RP-1 10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter
Dissection Microscope Nikon SM2645  
Super Glue Super Glue Corporation SGH2 2g tube
Omni Drill 35 World Precision Instruments 503-598  
Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4 World Precision Instruments 501860 0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm)
Low Temp Cautery Kit World Precision Instruments 500391  
Manual Micromanipulator World Precision Instruments M3301R  
Dextran Conjugated Alexa Fluor 568 Invitrogen D-22912 2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings
Epifluorescent Microscope Nikon E600 FN A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths
Low Power Objective Nikon 93182 CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm
High Power Objective Nikon 93148 CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm
White Light Source Dolan-Jenner Model 190 Fiber Optic Illuminator
Fluorescent Light Source Lumen Dynamics X-Cite 120Q  
Low-light Level Camera Photometrics CoolSnap ES  
Digital Manometer Omega Engineering HHP-201  
Motorized Micromanipulator Sutter Instruments MP-285  
Headstage Molecular Devices CV-7B Axon Instruments
Amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B Axon Instruments
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1322A Axon Instruments
Isolated Pulse Stimulator A-M Systems 2100  
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ’0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament
Pipette Glass World Precision Instruments 1B100F-4 Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID)

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References

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Lyons-Warren, A. M., Kohashi, T., Mennerick, S., Carlson, B. A. Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo. J. Vis. Exp. (76), e3921, doi:10.3791/3921 (2013).More

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