Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

جرذ الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق: نموذج للتحقيق في حيوية الخلوي شارك في الأوعية الدموية

doi: 10.3791/3954 Published: May 20, 2012

Summary

توضح هذه المقالة نموذج بسيط لتحفيز الأوعية الدموية في مساريق الفئران. نموذج تنتج زيادات هائلة في مجال الشعرية، التي تنتشر الأوعية الدموية والأوعية الدموية أكثر كثافة دورة زمنية قصيرة نسبيا في الأنسجة التي تسمح EN تصور وجه من شبكات الاوعية الدموية الدقيقة كله وصولا الى مستوى خلية واحدة.

Abstract

Microvacular نمو الشبكة وإعادة عرض من الجوانب الحاسمة لالتئام الجروح، والالتهابات، واعتلال الشبكية السكري، ونمو الورم والحالات المرضية الأخرى 1 و 2. ويعزى عادة إلى نمو شبكة الأوعية الدموية، الذي يعرف بأنه نمو أوعية جديدة من السفن الموجودة من قبل. كما عائية عملية مرتبطة مباشرة تخلق الشرايين، الذي يعرف بأنه اكتساب الشعرية من طلاء خلية حول الأوعية وتوسيع الوعاء. وغني عن القول الأوعية الدموية معقد وينطوي على عدة لاعبين على مستوى الخلوية والجزيئية 3. فهم كيف يمكن لشبكة الاوعية الدموية الدقيقة ينمو يتطلب التعرف على ديناميات المكانية والزمانية على طول التسلسل الهرمي للشبكة على مدار الساعة من الأوعية الدموية. هذه المعلومات هو أمر حاسم لتطوير علاجات تستهدف التلاعب نمو الأوعية.

نموذج الاهتمام لأمور ظاهرية الموضحة في هذه المقالة يمثل بسيط، نموذج يمكن استنساخه لstimulating الأوعية الدموية في مساريق الفئران. تم تكييفه من التئام الجروح في الفئران نماذج مساريق 4-7، و هو بديل لتحفيز الأوعية الدموية في مساريق عن طريق الحقن الملكية الفكرية المؤيدة للعائية وكلاء 8 و 9. نموذج الاهتمام لأمور ظاهرية غير جذابة لأنها تتطلب الحد الأدنى من التدخل الجراحي وتنتج دراماتيكي، ويزيد من استنساخه في براعم الشعرية، مجال الأوعية الدموية والأوعية الدموية أكثر كثافة دورة زمنية قصيرة نسبيا في الأنسجة التي تسمح لتصور ثنائية الأبعاد من شبكات الاوعية الدموية الدقيقة كله وصولا الى واحد خلية مستوى. حفز النمو يعكس ردود عائية الطبيعية في بيئة الفسيولوجية دون تدخل من الجزيئات عائية الأجنبية. باستخدام طرق وضع العلامات المناعى، وقد ثبت هذا النموذج مفيدا للغاية في تحديد أحداث رواية الخلوية العاملة في الأوعية الدموية. ويمكن ربط المحققون بسهولة المقاييس عائية أثناء وقت من اعادة عرض مع الوقت ليرة سوريةديناميات ecific، مثل التغيرات المظهرية الخلوية أو التفاعلات الخلوية 4، 5، 7، 10، 11.

Protocol

1. الجراحية انشاء إجراء ملاحظات

  1. قبل جراحة تعقيم المعدات الجراحية والأدوات. اللوازم المستخدمة في إجراء العمليات الجراحية ومعقمة في كل الفئران تشمل 1 ثنى أن layed بها باعتبارها سطح معقم لوضع الصكوك، لتوضع 1 الستارة مع وجود ثقب قبل قطع حوالي 0.5 × 1.5 في في في مركز مدى الفئران ، والشاش. وسوف الثقب قبل قطع على الستارة تتلاءم مع شق على الفئران. الأدوات اللازمة لعملية جراحية وتشمل 1 زوج من مقص القياسية التي تستخدم لخفض مواد خياطة الجروح، ملقط سنتين وحامل إبرة دقيقة للتعامل مع وتجتاح لخياطة الجروح، ومشرط بشفرة. لدينا قائمة الأدوات المشتركة المستخدمة من قبل مختبر لدينا في جدول المواد الجراحية وأدوات محددة. ومع ذلك، اختيار أداة النهائي يعتمد على تفضيلات مجرب.
  2. إعداد مساحة لعملية جراحية. وضع 100 مل 0.9٪ حقيبة ملحي معقم تحت وسادة التدفئة للتأكد من أن المياه المالحة التي تأتي في اتصال ثوإيث النسيج مساريق مسبقا تحسنت إلى 37 درجة مئوية تقريبا كبديل للالمالحة، يمكنك استخدام محلول رينغر أو آخر العازلة الفسيولوجية. وضع الأدوات الجراحية المعقمة والإمدادات على الستارة العقيمة ليسهل الوصول إليها أثناء إجراء الاهتمام لأمور ظاهرية. أيضا، وسوف تحتاج معقم تطبيقها طرف القطن ومناسبة 3 أنواع من الخيوط (4-0، 5-0، 7-0، و). الحزم يجعل متأكد من التحديد المسبق لفتح بحيث يمكن الوصول إلى مواد مع معالجة عقيمة. أخيرا، تطهير مرحلة ما قبل التغيير من البلاستيك من تخبط في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة لا تقل مدة 5 دقائق. المرحلة هو 100 طبق بيتري ملم مع ثقب بيضاوي الشكل خفض في مركز (الشكل 1). ويمكن استخدام أداة لجعل DREMEL في البداية، وعند الضرورة، وتوسيع الحفرة. بعد إجراء ثقب، مصنوعة من البلاستيك حواف القطع على نحو سلس باستخدام الرمل ورقة من الحبوب المختلفة. ثم يتم غسل المرحلة، وأخيرا، إما الصلصال الخاملة (التي تم شراؤها من متجر الحرفية المحلية) أو silicعلى الغراء يضاف إلى حافة حفرة في أجل توفير المثارة، سطح أملس. قبل الاتصال مع الأنسجة، فإن المرحلة تحتاج إلى شطف بشكل كاف مع ملحي معقم.
  3. لهذا النموذج من الأوعية الدموية، ونحن عادة استخدام الذكور البالغين فئران ويستار (350 ± 25 ز). ويمكن استخدام سلالات الفئران الأخرى والأعمار. في مختبرنا، هي تخدير الفئران عن طريق الحقن العضلي مع الكيتامين (80 ملغم / كغم من وزن الجسم)، زيلازين (8 ملغ / كغ من وزن الجسم)، والأتروبين (0.08 ملغم / كغم من وزن الجسم). بعد ما يقرب من 5 دقائق، ويتأكد من تأثير التخدير وحلق جلد فأر في البطن.

2. نموذج الفئران مساريق الاهتمام لأمور ظاهرية

  1. وضع فأر تخدير على ظهره على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. وتستخدم تقنيات التعقيم أثناء العملية الجراحية. ارتداء قفازات معقمة وعدم السماح الأدوات واللوازم في الاتصال غير معقمة السطوح الأخرى من أنسجة الفئران.
  2. تنظيف منطقة البطن بالتناوب مع مناديل USIنانوغرام في شاش معقم غارقة في الآيزوبروبيل 70٪ واليود.
  3. باستخدام شفرة مشرط، وجعل صغيرة (حوالي 0.75 بوصة) شق طولي على امتداد الجلد وبعد ذلك الخط الأبيض ما يقرب من 1 بوصة أقل من القص.
  4. وضع الستارة قبل قطع أكثر من قسم في البطن بحيث ينسجم مع افتتاح الشق.
  5. تطبق بلطف الضغط حول الجرح. هذا سوف يسفر في التعرض للأمعاء صغيرة بما يكفي ليتم التعرف بسهولة.
  6. باستخدام أدوات تطبيقها طرف والقطن، وبرفق خارج جزء من الأمعاء الدقيقة وتحديد موقع الدقاق. كما يتم سحبها من مساريق، ينبغي أن layed بلطف عليها في مرحلة من البلاستيك (الشكل 2).
  7. 6-8 تحديد النوافذ المساريقي أوعية دموية. يتم تعريف نافذة المساريقي كما غشاء رقيق شفاف في ما بين الأزواج شريان / وريد تغذية الأمعاء الدقيقة (الشكل 2).
  8. تسجيل الوقت بدءا من الاهتمام لأمور ظاهرية. ترك mesenteexteriorized راي قسم لمدة 20 دقيقة. خلال الفترة من الاهتمام لأمور ظاهرية، استخدم محقنة معقمة (5 مل) لتجديد بشكل متقطع المالحة في طبق بيتري للتأكد من أن الأنسجة لا تزال مغمورة ولا تجف.
  9. خلال فترة التعرض لمدة 20 دقيقة، بمناسبة 2 النوافذ المساريقي موقعا مركزيا مع خياطة 7-0 العقيمة. وينبغي بذل علامات في منطقة بالقرب من الدهون في الأمعاء.
  10. عودة المنطقة exteriorized من مساريق إلى تجويف البطن.
  11. إغلاق عضلات البطن مع خياطة حيدة 5-0 في نمط توقف.
  12. إغلاق الجلد مع خياطة حيدة 4-0 في نمط توقف.
  13. مسح منطقة خياطة بالتناوب مع تقضي باستخدام شاش معقم غارقة في isopropoyl 70٪ واليود.
  14. انتشار العين هلام مواد التشحيم في كلتا العينين من الفئران. الغرض من زيوت التشحيم في العين هو منع جفاف القرنية أثناء العملية الجراحية والانتعاش. ينبغي أن تطبق في تطبيق مواد التشحيم العينقبل بدء التدخل الجراحي. إذا كان ذلك ضروريا، إعادة تطبيق مواد التشحيم العين قبل عودته إلى فأر قفصه لتحقيق الانتعاش.

3. حصاد الأنسجة والتثبيت

  1. في يوم آخر من التحفيز الفائدة، وتخدير والموت ببطء في الفئران. في مختبرنا، هي تخدير الفئران عن طريق الحقن العضلي مع الكيتامين (80 ملغم / كغم من وزن الجسم)، زيلازين (8 ملغ / كغ من وزن الجسم)، والأتروبين (0.8 ملغ / كغ من وزن الجسم)، ثم الموت الرحيم عن طريق الحقن داخل القلب من beuthanasia. Beuthanasia هو بنتوباربيتال الصوديوم / الفينيتوين الحل الذي يمكن أن تستخدم في القتل الرحيم سريع وغير مؤلم. لكل فأر مختبر لدينا تضخ عادة 0،1-0،2 مل.
  2. إعادة فتح تجويف البطن وإزالة بلطف الأمعاء الدقيقة وتحديد الإطارين بعلامات.
  3. قطع كل من النوافذ المساريقي exteriorized باستخدام ملقط ومقص الدقيقة. بما في ذلك الحدود من نافذة في الدهون هو مفيد للنسيج في وقت لاحق نشر على شرائح المجهر. فورا، غمر كل نافذة في برنامج تلفزيوني. عندما قطع، في محاولة لتجنب قطع طريق الشريان / الوريد أزواج داخل الحدود الدهون من النوافذ لتقليل دم محتمل ملء النوافذ. أيضا، من خلال تقليل قطع الأمعاء أن النتائج في محتوى الأمعاء الاتصال النوافذ.
  4. استخدام ملقط لنشر الأنسجة على شرائح المجهر موجبة. يمكن تركيب اثنين من الأنسجة لكل شريحة.
  5. السماح للأنسجة لتجف جزئيا واستخدام شفرة مشرط إزالة الدهون الزائدة.
  6. الأنسجة الآن على استعداد لتكون ثابتة. ويمكن استخدام وسائل تثبيت نموذجي. في مختبرنا، ونحن عادة إصلاح الشرائح في الميثانول (-20 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة. كما تم وضع العلامات ناجحة أجريت مع الأنسجة غير المثبتة. قد طرق تثبيت تعتمد على الأجسام المضادة التي تفضلها.

4. المناعي لبروتين الأنسجة

  1. عموما يمكن أن توصف الآن الأنسجة وفقا لتعليمات لكل الأجسام المضادة للالمناعية. وانطلاقا من اهتمامنا في تحديد الأدوارمن pericytes الأوعية الدموية خلال الأوعية الدموية، مختبرنا تصف عادة عن الخلايا البطانية وحول الأوعية 10، 12، 13. التسميات مفيدة لتحديد الخلايا البطانية على طول التسلسل الهرمي للشبكات الاوعية الدموية الدقيقة هي الأجسام المضادة لمكافحة PECAM أو BSI يكتين. علامات خلية حول الأوعية المستخدمة في هذه الأنسجة تشمل NG2، desmin، الأكتين SM-α، PDFGRβ، والطبقة الثالثة β-تويولين. أدناه، في القسم 3.3، لدينا قائمة بروتوكولات لاللونية والبروتوكولات المناعي لبروتين فلوري PECAM.
  2. قبل حضانة الجسم المضاد الأولي الابتدائي، والشرائح هي فراغ المجفف لازالة الزائدة حل العازلة. أيضا، وترد في البداية الأنسجة باستخدام قلم الشمع لمنع تدفق غير المنضبط للحلول الأضداد بعيدا عن الأنسجة. أخيرا، يتم اتباع جميع الخطوات التي وصفها خطوات الغسيل. لغسل الخطوات، يتم وضع الشرائح داخل الجرار تلطيخ. ويتم تبادل الحل عازلة 3 مرات خلال فترة الغسيل.
  3. البطانية إجراءات وضع العلامات خلية الجسم المضاد: <ف الطبقة = "jove_step"> PECAM اللونية Lableing

    1. الأجسام المضادة الأولية حضانة: بالتنقيط حوالي 100-200 مل من محلول الجسم المضاد الأولي (1:200 الفأر وحيدة النسيلة المعقدة البيروكسيديز CD31 الضد المخفف في عازلة الأجسام المضادة (0.1٪ سابونين في برنامج تلفزيوني + جيش صرب البوسنة 2٪)) على رأس لكل الأنسجة؛ تأكد من النسيج كله مغطاة حل الأجسام المضادة. حضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    2. غسل الأنسجة مع سابونين PBS +0.1٪ لمدة 30 دقيقة.
    3. الثانوية حضانة الأضداد: حل بالتنقيط الجسم المضاد الثانوي (VECTASTAIN حل ABC النخبة من مختبرات النواقل؛ 1 البيروكسيديز streptavidin حل الأجسام المضادة الثانوية) على رأس الأنسجة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    4. غسل الأنسجة مع سابونين PBS +0.1٪ لمدة 30 دقيقة.
    5. احتضان الأنسجة مع ناقلات نوفا الأحمر لمدة 15 دقيقة. ثم يرتفع الأنسجة بالماء.
    6. الشرائح جبل: تراجع الشرائح في الايثانول 95٪ 10 مرات. غمر الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة. غمر الشرائح في آخر الإيثانول بنسبة 100٪ لذلكlution لمدة 2 دقيقة. ثم غمر شرائح متتالية في حلول الزيلين بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة لكل منهما. السماح ليجف، وتغطية الأنسجة مع طبقة رقيقة من VectaMount وساترة 1.

    PECAM نيون وضع العلامات

    1. الأجسام المضادة الأولية حضانة: بالتنقيط حوالي 100-200 مل من محلول الجسم المضاد الأولي (1:200 الفأر وحيدة النسيلة المعقدة البيروكسيديز CD31 الضد المخفف في عازلة الأجسام المضادة (0.1٪ سابونين في برنامج تلفزيوني + جيش صرب البوسنة 2٪)) على رأس لكل الأنسجة؛ تأكد من النسيج كله مغطاة حل الأجسام المضادة. حضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    2. غسل الأنسجة مع سابونين PBS +0.1٪ لمدة 30 دقيقة.
    3. الثانوية حضانة الجسم المضاد:. حل بالتنقيط الجسم المضاد الثانوي ((1:100 Streptavidin-CY3 المخفف في عازلة الأجسام المضادة (0.1٪ سابونين في برنامج تلفزيوني + جيش صرب البوسنة 2٪)) على رأس الأنسجة احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    4. غسل الأنسجة مع سابونين PBS +0.1٪ لمدة 30 دقيقة.
    5. الشرائح جبل: بالتنقيط 50:50 برنامج تلفزيوني مع الجلسرين على رأس الأنسجة. تغطيةمع انزلاق الغطاء. ثم، واستخدام طلاء الأظافر لاغلاق الفجوة بين زلة الغطاء والشرائح.

5. ممثل النتائج

يتم عرض الصور ممثل الأنسجة مساريق الفئران المسمى immunohistochemically لPECAM في الشكل 3. PECAM وضع العلامات ويحدد جميع أنواع السفن على طول التسلسل الهرمي للشبكات إعادة عرض الاوعية الدموية الدقيقة، ويمكن استخدامها لتحديد قياسات محددة عائية في تنشيط وقت آخر نقطة. PECAM وضع العلامات كما يسمح لتحديد الشرايين مقابل الأوردة. الشرايين المغذية تظهر عادة أصغر أقطار وممدود مورفولوجيا الخلايا البطانية مقارنة الوريدات الاقتران (الشكل 4). ويمكن تحديد الشعيرات الدموية الشعرية وبراعم على أساس اوعية والوضع النسبي ضمن شبكة. الخصائص المميزة للشبكات إعادة عرض تتضمن زيادة الكثافة الشعرية التي تنتشر السفينة، منطقة أوعية دموية وtortuos وريديإيتي. الكمي للقياسات عائية مختلف يحدد مسار الوقت للنمو شبكة (الشكل 5). شعري تنبت من القائمة من قبل السفن، وقمم بين يوم 3 ويوم 5، ويعود إلى مستوى unstimulated من يوم 10. ويتبع هذه الزيادة عابر في شبكتها للزيادة في كثافة الأوعية الدموية ومنطقة أوعية دموية. كأدلة لإعادة عرض من السفن الكبيرة في هذا النموذج، وعدد من قطاعات شرين والوريد يزيد أيضا على مدار الساعة.

في مختبرنا، وقد استخدم هذا النموذج لتحديد التغييرات المظهرية الخلوية في نقطة زمنية محددة خلال هذه العملية إعادة عرض 10 و 11. على سبيل المثال، من الطبقة الثالثة β-تويولين يحدد pericytes على طول الأوعية عائية (الشكل 6). في الأنسجة unstimulated، من الطبقة الثالثة β-تويولين التعبير هي محددة العصب. في المقابل، في ذروة الشعرية تنتشر، وأعرب عن الطبقة الثالثة β-تويولين من الخلايا المحيطة بالأوعية. هذا النوعمن نتيجة تسلط الضوء على استخدام هذا النموذج عائية بسيطة وقوية لتحديد أنواع الخلايا رواية المشاركة في عملية عائية.

الشكل 1
الشكل 1. صور من مرحلة البلاستيكية قبل وبعد التعديل. مرحلة ما قبل التعديل هو 100 طبق بيتري ملم. التعديلات تشمل خفض حفرة بيضاوية في وسط وإضافة لاحقة من الصلصال أو غراء السيليكون إلى حافة الحفرة لإنشاء السطح، والتي أثيرت على نحو سلس. هذا السطح يوفر الحدود الداخلية التي تسهل superfusion من النوافذ المساريقي exteriorized. شريط المقياس 1 سم.

الشكل 2
الشكل 2. صورة من منطقة المساريقي exteriorized. وتعرف النوافذ المساريقي كما الأغشية الرقيقة الشفافة بين أزواج شريان / وريد تغذية الأمعاء الدقيقة. خلال الاهتمام لأمور ظاهريةمدة، وضعت خارج المنطقة المساريقي ومغمورة في المياه المالحة داخل طبق بيتري المعدلة. خامل الصلصال الأصفر يوفر سطح أملس لمساريق ليتم سحبها من خلال الفتحة قبل قطع. شريط المقياس 1 سم.

الشكل (3)
الشكل 3. صور الممثل شبكات الاوعية الدموية الدقيقة المساريقي من الأنسجة unstimulated والأنسجة في 3 و 10 أيام آخر الاهتمام لأمور ظاهرية من مساريق. حددت PECAM وضع العلامات التسلسل الهرمي للشبكات الاوعية الدموية الدقيقة، بما في ذلك الشرايين (A)، الوريدات (V) والشعيرات الدموية (C). تنبيه آخر، عرض شبكات الاوعية الدموية الدقيقة في زيادة شبكتها الشعرية (رؤوس السهم) وكثافة السفينة. شريط المقياس 100 ميكرون.

الشكل 4
صور الممثل الشكل 4. من شرين / أزواج الوريد ضمن الكبار الفئران المساريقي شبكة الاوعية الدموية الدقيقةق. في كل من صور، ويمكن التمييز بين الشرايين (A) من الوريدات (V) على أساس القطر أصغر النسبية وممدود مورفولوجيا الخلايا البطانية. الحانات هي مقياس 20 ميكرون.

الشكل 5
الشكل 5. الكمي الممثل من المقاييس عائية على مدار الساعة من الاوعية الدموية الدقيقة نمو آخر الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق. أ) منطقة الأوعية الدموية في منطقة الأنسجة. ب) عدد من براعم الشعرية في مجال الأوعية الدموية. ج) طول الأوعية الدموية في مجموع منطقة الأوعية الدموية. * يمثل فارقا كبيرا مقارنة مع مجموعة unstimulated. وأدلى المقارنات الإحصائية باستخدام أنوفا واحد في اتجاه ويليه اختبار دان. (P <0.05). الأمم المتحدة تمثل unstimulated.

الشكل (6)
الشكل 6. الصور فلوري الممثل شبكات الاوعية الدموية الدقيقة المساريقي من الأنسجة unstimulated والأنسجة في 3 و 10يوما بعد الاهتمام لأمور ظاهرية من مساريق. مناعي PECAM وضع العلامات (الحمراء) ويحدد الخلايا البطانية، والطبقة الثالثة β-تويولين وضع العلامات (الخضراء) ويحدد الأعصاب (رؤوس السهم) والخلايا المحيطة بالأوعية (سهام). الخلايا المحيطة بالأوعية upregulate عابر من الطبقة الثالثة β-تويولين خلال الشعيرات الدموية التي تنتشر. في شبكات الاوعية الدموية الدقيقة unstimulated، من الطبقة الثالثة β-تويولين هو العصب محددة وليس تحديد الخلايا حول الأوعية. 3 تحفيز آخر أيام، من الطبقة الثالثة β-تويولين تصف بشكل إيجابي على طول الخلايا المحيطة بالأوعية microvessels. بعد يوم 10، من الطبقة الثالثة نمط التعبير β-تويولين يبدأ بالعودة الى سيناريو unstimulated. شريط النطاق هو 50 ميكرون.

الشكل 7
الشكل 7. صور دعم جدوى من الخلايا مسبقا المسمى تتبع تطبيقها محليا خلال نمو الاوعية الدموية الدقيقة شبكة يحفزه على الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق. وsuperfused الخلايا خلال mesenterIC النوافذ خلال الفترة الاهتمام لأمور ظاهرية لمدة 20 دقيقة. وقد لوحظت 1 يوم بعد الجراحة، وخلايا الجاذبة المسمى (الحمراء) في الطائرة سيدة التنسيق مع PECAM إيجابي microvessels (الخضراء). أظهرت قدرا تقريب A، B) ومن الأمثلة على تسمية الخلايا الجاذبة نخاع العظم وممدود morphologies. في بعض الحالات، كان ممدود (الأسهم) على طول الخلايا microvessels. C) المسمى مثال من مجموعة من الخلايا الجذعية الوسيطة الجاذبة بالقرب من غيض من شعري برعم (السهم). الحانات النطاق هي 50 ميكرومتر (A)، و 20 ميكرون (B، C).

Discussion

وذكرت ونموذج الاهتمام لأمور ظاهرية في عام 2006 ويتم تكييف سابقة الميكانيكية نماذج إصابة مساريق الفئران من الأوعية الدموية 4-7 وتعطي نتائج مماثلة لنماذج راسخة حقن الملكية الفكرية التي تستفيد من الفئران مساريق 9. تم تحديد تجريبيا في الوقت الاهتمام لأمور ظاهرية 20 دقيقة على إنتاج رد فعل قوي عائية. في حين يمكن أن تختلف هذه الفترة الزمنية، فإنه لا يسمح للتطبيق المحلي لمثبطات عائية (4) لدراسات الآلية والتطبيق المباشر للخلايا الخارجية للدراسات نسب الخلية. ويدعم جدوى دمج الخلية إلى إعادة عرض الأنسجة المساريقي بواسطة الدراسات الأولية في مختبرنا باستخدام مسبقا المسماة خلايا نخاع العظم والخلايا الجذعية الوسيطة (الشكل 7)، ونجاح التحقيق في مصير الدهنية المشتقة من انسجة بشرية الملكية الفكرية حقن الخلايا 14 . في مختبرنا، وقد استخدمنا هذا النموذج لتحديد خلية حوطية كايسيotypic التغييرات على مدار الساعة للاستجابة عائية (10) وإلى تقييم إمكانات عائية خلال الحالات المرضية، مثل ارتفاع ضغط الدم 12. ويمكن أيضا للاستجابة عائية وتغيرات النمط الظاهري الخلية المرتبطة بهذا النموذج يمكن ملاحظته في الموديلات الأخرى المساريقي الفئران عائية بما في ذلك التعرض للنقص الأكسجة المزمن 10 و 11.

وجود قيود على نموذج الاهتمام لأمور ظاهرية هو أن الآليات الدقيقة اثار من الأوعية الدموية غير معروفة. وقد تم ربط الاهتمام لأمور ظاهرية للمساريق إلى تحبب الخلايا البدينة ومستويات الهيستامين زيادة بعد إجراء مزيد من التحقيق مطلوب لكسب مزيد من التبصر. الحافز عائية مما لا شك فيه متعدد مضروب، مما ينتج عنه استجابة إعادة عرض قوي عبر التسلسل الهرمي لشبكة الاوعية الدموية الدقيقة. في حين أن آليات غير معروف يبقى نقد الرئيسية لهذا النموذج، واستنساخ وبساطته جعلها جذابة للتعرف على ديناميات الخلوية involفيد في العملية الشعرية المعقدة بطبيعتها تنتشر. يتم اعتماد استنساخ هذا النموذج من قبل مقاييس عائية مماثلة على مدار الساعة للنمو الاوعية الدموية الدقيقة عبر شبكة سلالات الفئران متعددة (ويستار الذكور والإناث، سبراغ داولي) في الدراسات التي نشرت سابقا من مختبرنا 10 و 12. منذ ذلك الحين، أن غالبية البالغين الأنسجة المساريقي الفئران هي أوعية دموية، ونموذج يسمح أيضا لأنسجة متعددة للفحص لكل حيوان. للأسف، وهذا النموذج لا ينطبق بالطبع على نماذج الماوس الوراثية ويندوز المساريقي الماوس على الأوعية الدموية أقل الأم، وفي تجربتنا، وتفتقر عادة ملاحظتها الشبكات المتفرعة. التطبيقات المستقبلية تشمل التحقيق في وظائف سفينة خلال الأوعية الدموية داخل حيوي باستخدام المجهر في نقطة زمنية محددة، والتحقيق في ديناميات الخلوية ذات الصلة المشاركة في lymphangiogenesis وتكوين الخلايا العصبية. على الرغم من أن حجم الأوعية الدموية الأصلي في نافذة المساريقي يبدو أن ROUالنسبي ghly مع تقدم العمر، وقد لاحظنا المتفرعة شبكات الاوعية الدموية الدقيقة في فئران ويستار الذكور في سن 4-5 أسابيع من العمر. هذه الملاحظات تشير إلى أنه يمكن أيضا نموذج الاهتمام لأمور ظاهرية يمكن تطبيقها على مقارنة الاختلافات عائية عبر العصور.

Disclosures

ليس لدينا ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مجلس الحكام في دولة LEQSF لويزيانا (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) وارتفاع ضغط الدم تولان ومركز الكلى للتميز التي تمولها منحة المعاهد الوطنية للصحة P20RR017659-08 (PI : L. غابرييل نافار).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12"x12" Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instruments Co. RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge;0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Graefe Forcep Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length
4-0 suture Ethicon Inc. 699G (1.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament
5-0 suture Ethicon Inc. 8556 (1.0 metric) PROLENE Polyprolene Suture Blue Monofilament
7-0 suture Ethicon Inc. 1647G (0.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament
Castroviejo Micro Needle Holder Fine Science Tools 12060-02 Tip Width:0.6mm
Clamping Length:5mm
Length:9cm
Straight tip
Castroviejo Needle Holder Fine Science Tools 12565-14 Tip Shape:Straight
Tip Width:1.5mm
Clamping Length:10mm
Scissors:No
Lock:Yes
Length:14cm
Serrated:Yes
Scalpel Handle Roboz Surgical Instruments Co. RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Petri Dish Fisher Scientific 08-757-13 Beveled Ridge, Slippable
Table of Specific Surgical Materials and Tools.
Beuthanasia Merck & Co. MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium
Ketamine Fort Dodge Animal Health MWI #: 000680 Kateset 100 mg/ml
Xylazine Lloyd, Inc. MWI #: 009307 Anased 100 mg/ml (Ordered from MWI Veterinary Supply)
Saline Hospira Inc. 94-217-JT
PBS Sigma-Aldrich 011M8207
Saponin Sigma-Aldrich BCBB4080
PECAM (CD31) BD Biosciences 553371
Streptavidin-CY3 Jackson ImmunoResearch 016-160-084
BSA Jackson ImmunoResearch 096555
VECTASTAIN Elite ABC Vector Laboratories PK-6100
Vector Nova Red Vector Laboratories SK-4800
VectaMount Vector Laboratories H-500
Table of Specific Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407, 249-257 (2000).
  2. le Noble, F. A., Stassen, F. R., Hacking, W. J., Struijker Boudier, H. A. Angiogenesis and hypertension. J. Hypertens. 16, 1563-1572 (1998).
  3. Peirce, S. M., Skalak, T. C. Microvascular remodeling: a complex continuum spanning angiogenesis to arteriogenesis. Microcirculation. 10, 99-111 (2003).
  4. Anderson, C. R., Ponce, A. M., Price, R. J. Immunohistochemical identification of an extracellular matrix scaffold that microguides capillary sprouting in vivo. J. Histochem. Cytochem. 52, 1063-1072 (2004).
  5. Ponce, A. M., Price, R. J. Angiogenic stimulus determines the positioning of pericytes within capillary sprouts in vivo. Microvasc. Res. 65, 45-48 (2003).
  6. Franzen, L., Ghassemifar, R., Malcherek, P. Experimental mast cell activation improves connective tissue repair in the perforated rat mesentery. Agents Actions. 33, 371-377 (1991).
  7. Anderson, C. R., Hastings, N. E., Blackman, B. R., Price, R. J. Capillary sprout endothelial cells exhibit a CD36 low phenotype: regulation by shear stress and vascular endothelial growth factor-induced mechanism for attenuating anti-proliferative thrombospondin-1 signaling. Am. J. Pathol. 173, 1220-1228 (2008).
  8. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
  9. Norrby, K. C. Rat Mesentery Angiogenesis Assay. J. Vis. Exp. (52), e3078 (2011).
  10. Murfee, W. L., Rehorn, M. R., Peirce, S. M., Skalak, T. C. Perivascular cells along venules upregulate NG2 expression during microvascular remodeling. Microcirculation. 13, 261-273 (2006).
  11. Stapor, C. P., Murfee, L. W. Identification of class III β-tubulin as a marker of angiogenic perivascular cells. Microvascular Research. Forthcoming (2011).
  12. Yang, M., Aragon, M., Murfee, W. L. Angiogenesis in Mesenteric Microvascular Networks from Spontaneously Hypertensive Versus Normotensive Rats. Microcirculation. (2011).
  13. Robichaux, J. L. Lymphatic/Blood endothelial cell connections at the capillary level in adult rat mesentery. Anat. Rec. (Hoboken). 293, 1629-1638 (2010).
  14. Amos, P. J. IFATS collection: The role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype. Stem Cells. 26, 2682-2690 (2008).
جرذ الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق: نموذج للتحقيق في حيوية الخلوي شارك في الأوعية الدموية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, M., Stapor, P. C., Peirce, S. M., Betancourt, A. M., Murfee, W. L. Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis. J. Vis. Exp. (63), e3954, doi:10.3791/3954 (2012).More

Yang, M., Stapor, P. C., Peirce, S. M., Betancourt, A. M., Murfee, W. L. Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis. J. Vis. Exp. (63), e3954, doi:10.3791/3954 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter