Summary
Dit artikel beschrijft een eenvoudig model voor het stimuleren angiogenese in de rat mesenterium. Het model produceert dramatische toename in capillaire kiemen, vasculaire gebied en vasculaire dichtheid over een relatief korte tijd cursus in een weefsel die het mogelijk maakt en face visualisatie van hele microvasculaire netwerken tot in de enkele cel niveau.
Abstract
Microvacular groei van het netwerk en hermodellering zijn belangrijke aspecten van wondgenezing, ontsteking, diabetische retinopathie, de groei van tumoren en andere aandoeningen 1, 2. Groei van het netwerk wordt vaak toegeschreven aan angiogenese, gedefinieerd als de groei van nieuwe schepen van reeds bestaande schepen. Het angiogene proces wordt ook direct gekoppeld aan arteriogenese, gedefinieerd als de capillaire verwerving van een perivasculaire cel coating en vat de uitbreiding. Onnodig om te zeggen, angiogenese is complex en omvat meerdere spelers op cellulair en moleculair niveau 3. Het begrijpen van hoe een microvasculaire netwerk groeit vereist het identificeren van de ruimtelijke en temporele dynamiek langs de hiërarchie van een netwerk over het tijdsverloop van angiogenese. Deze informatie is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van therapieën die gericht zijn op het manipuleren van schip groei.
De uittreding model beschreven in dit artikel is een eenvoudige, reproduceerbare model voor stimulerenkening angiogenese in het mesenterium rat. Het werd aangepast van wondgenezing modellen in de rat mesenterium 4-7, en is een alternatief voor de angiogenese te stimuleren in het mesenterium via ip injecties van pro-angiogene middelen 8, 9. De uittreding model is aantrekkelijk omdat het vereist een minimale chirurgische ingreep en produceert dramatisch, reproduceerbare toename van de capillaire spruiten, vasculaire gebied en vasculaire dichtheid over een relatief korte tijd cursus in een weefsel dat zorgt voor de twee-dimensionale visualisatie van hele microvasculaire netwerken tot enkele celniveau. De gestimuleerde expansie is natuurlijk angiogene responsen in een fysiologische omgeving zonder tussenkomst van vreemde angiogene moleculen. Met behulp van immunohistochemische etikettering methoden, is dit model bewezen zeer nuttig in het identificeren van nieuwe cellulaire gebeurtenissen betrokken bij de angiogenese. Onderzoekers kunnen gemakkelijk correleren de angiogene statistieken in de tijd loop van de verbouwing met de tijd specific dynamiek, zoals cellulaire fenotypische veranderingen of cellulaire interacties 4, 5, 7, 10, 11.
Protocol
1. Chirurgische Procedure Set-Up Notes
- Voorafgaand aan de operatie steriliseren chirurgisch materiaal en instrumenten. Diensten gebruikt voor steriele chirurgische procedure voor elke rat omvatten een gordijn worden aangelegd als een steriel oppervlak voor de plaatsing van instrumenten, een laken met een voorgesneden gat 0,5 cm x 1,5 in het midden geplaatst boven de rat en gaas. De voorgesneden gat in het laken zal zich aanpassen aan de incisie gemaakt op de rat. Instrumenten voor de operatie behoren een standaard schaar gebruiken om hechtmateriaal snijden, twee tang en een fijne naald houder voor het hanteren en grijpen van het hechtmateriaal en een scalpel een mes. Wij hebben de gemeenschappelijke instrumenten gebruikt door ons laboratorium in de tabel van specifieke chirurgische materialen en gereedschappen. Echter, de uiteindelijke keuze van gereedschap hangt af van experimentator voorkeuren.
- Bereid de operatie ruimte. Plaats een 100 ml 0,9% steriele zoutoplossing zak onder een verwarmingselement dat de zoutoplossing dat in contact komt wet het mesenterium weefsel verwarmen tot ongeveer 37 ° C. Als alternatief voor zout kunt u Ringer's oplossing of een andere fysiologische buffer. Indeling gesteriliseerde chirurgische instrumenten en voorraden aan een steriel laken voor een gemakkelijke toegang tijdens de uittreding procedure. Ook moet u steriel wattenstaafje applicators en de juiste 3 soorten hechtingen (4-0, 5-0 en 7-0). Zorgt ervoor dat pakketten worden zo vooraf geopend dat de materialen kan worden benaderd met een steriele behandeling. Tenslotte desinfecteren pre-gemodificeerde kunststof fase door onderdompelen in 100% ethanol gedurende minstens 5 minuten. De fase is een 100 mm Petrischaal met een elliptische gat in het midden (figuur 1). Een Dremel kan worden gebruikt in eerste instantie te maken en zo nodig te verbreden het gat. Nadat het gat is gemaakt, zijn de randen van de uitsparing plastic glad gemaakt met schuurpapier verschillende graansoorten. De fase wordt vervolgens gewassen en tenslotte een inert klei (gekocht bij een handwerk slaan) SILICop lijm wordt toegevoegd aan de rand van de opening in om een verhoogd, glad oppervlak. Voorafgaand aan contact met het weefsel, het stadium moet voldoende zijn gespoeld met steriele zoutoplossing.
- Voor dit model van angiogenese, Wij gebruiken meestal de volwassen mannelijke Wistar ratten (350 ± 25 g). Andere ratten stammen en leeftijden kan worden gebruikt. In ons laboratorium ratten zijn verdoofd via een intramusculaire injectie met ketamine (80 mg / kg lichaamsgewicht), xylazine (8 mg / kg lichaamsgewicht), en atropine (0,08 mg / kg lichaamsgewicht). Na ongeveer 5 minuten, wordt het effect van de anesthesie bevestigd en de rat buikhuid wordt geschoren.
2. Rat mesenterium uittreding Model
- Plaats de verdoofde rat op zijn rug op een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur te handhaven. Aseptische technieken worden gebruikt tijdens de chirurgische ingreep. Draag steriele handschoenen en staan niet toe dat instrumenten en leveringen aan niet-steriele andere oppervlakken dan de rat weefsels contact op te nemen.
- Maak buikstreek met afwisselende doekjes using van de steriel gaasje gedrenkt in 70% isopropyl en jodium.
- Met behulp van de scalpel, maak een klein (ongeveer 0,75 inch) longitudinale incisie langs de huid en vervolgens de linea alba ongeveer 1 cm onder het borstbeen.
- Leg de voorgesneden laken over de buik gedeelte, zodat de opening uitgelijnd met de incisie.
- Voorzichtig brengen druk aan rond de incisie. Dit zal gewoonlijk leiden tot blootstelling van de dunne darm genoeg is om gemakkelijk te worden geïdentificeerd.
- Met behulp van de katoen tip applicators, trek een deel van de dunne darm en zoek het ileum. Aangezien het mesenterium wordt getrokken moet voorzichtig worden aangelegd in de kunststof fase (figuur 2).
- Identificeer 6-8 gevasculariseerd mesenteriale ramen. Een mesenteriale venster wordt gedefinieerd als de dunne doorzichtige membraan tussen de arterie / ader paren toevoeren van de dunne darm (figuur 2).
- Noteer de begintijd van uittreding. Laat de mesentery sectie exteriorized gedurende 20 minuten. In de uittreding periode een steriele injectiespuit (5 ml) om het zout intermitterend vullen in een petrischaal aan dat het weefsel is ondergedompeld en niet uitdroogt.
- Tijdens de 20-minuten belichtingstijd, markeer de twee centraal gelegen mesenteriale ramen met steriele 7-0 hechtdraad. De merktekens worden gemaakt in het vet omgeving van de darm.
- Zet de exteriorized regio van het mesenterium naar de buikholte.
- Sluit de buikspier met 5-0 monofilament hechtdraad in onderbroken patroon.
- Sluit de huid met 4-0 monofilament hechtdraad in onderbroken patroon.
- Veeg de gehecht gebied met afwisselende vochtige doekjes via het steriel gaasje gedrenkt in 70% isopropoyl en jodium.
- Verspreid het oog glijmiddel op beide ogen van de rat. Het doel van smeren oog het drogen van de cornea voorkomen tijdens operatie en herstel. De toepassing van oog smeermiddel dient te worden toegepastvoor het begin van de chirurgische ingreep. Indien nodig, voordat opnieuw toe te passen eye smeermiddel wel terugbetaling van de rat om zijn kooi voor herstel.
3. Tissue Oogst en fixatie
- Op de dag van belang na de stimulatie, verdoven en euthanaseren van de rat. In ons laboratorium ratten zijn verdoofd via een intramusculaire injectie met ketamine (80 mg / kg lichaamsgewicht), xylazine (8 mg / kg lichaamsgewicht), en atropine (0,8 mg / kg lichaamsgewicht) en vervolgens gedood door intracardiale injectie van beuthanasia. Beuthanasia een natriumpentobarbital / fenytoïne oplossing kan worden gebruikt voor snelle en pijnloos euthanasie. Per rat ons laboratorium injecteert meestal 0,1 tot 0,2 ml.
- Heropen de buikholte en verwijder voorzichtig de dunne darm en zoek de twee gemarkeerde ramen.
- Knip elk van de exteriorized mesenteriale vensters met behulp van een tang en micro-schaar. Inclusief een grens van vet per venster is voordelig voor later weefsel verspreiden op objectglaasjes. Onmiddellijk, Dompel elk venster in PBS. Bij het snijden, probeer te voorkomen dat het doorsnijden van slagader / ader paren in het vet grens van de ramen om potentiële bloed vulling van de vensters te minimaliseren. Ook een minimum te beperken dwars door de darm die resulteert in darminhoud de ramen contact op te nemen.
- Gebruik een tang om weefsels te verspreiden op de positief geladen objectglaasjes. Twee weefsels kan worden gemonteerd per dia.
- Laat het weefsel gedeeltelijk drogen en met behulp van een scalpel verwijdert het teveel aan vet.
- Weefsels zijn nu klaar om te worden vastgesteld. Typische fixatie methoden kunnen worden gebruikt. In ons laboratorium men gewoonlijk vast de glaasjes in methanol (-20 ° C) gedurende 30 minuten. Succesvolle etikettering is ook uitgevoerd met de niet vastgelegde weefsels. Fixatie methodes zou kunnen is afhankelijk van uw voorkeur antilichaam.
4. Tissue immunokleuring
- Weefsels kunnen nu algemeen worden voorzien volgens de instructies per antilichaam voor immunohistochemie. Gezien onze interesse in het identificeren van de rollenvan vasculaire pericyten tijdens angiogenese, ons laboratorium labelt vaak voor endotheliale en perivasculaire cellen 10, 12, 13. Nuttig labels aan endotheelcellen te identificeren aan de hiërarchie van de microvasculaire netwerken zijn een anti-PECAM antilichaam of BSI-lectine. Perivasculaire cel markers gebruikt in dit weefsel zijn NG2, desmine, SM-α actine, PDFGRβ, en klasse III β-tubuline. Hieronder, in paragraaf 3.3, hebben we vermeld protocollen voor kleur-en tl-PECAM immunokleuring protocollen.
- Vóór de eerste primaire antilichaam incubatie glijbanen vacuum gedroogd om overmaat bufferoplossing te verwijderen. Ook zijn weefsels in eerste instantie aangegeven met een wax pen tot een ongecontroleerde stroom van antilichaam-oplossingen te voorkomen dat uit de buurt van het weefsel. Tenslotte worden alle stappen labelen gevolgd door wasstappen. Voor het wassen van stappen, worden dia's geplaatst in vlekken potten. De bufferoplossing wordt uitgewisseld 3 keer wassen van de duur.
- Endotheelcellen antilichaam etiketteringsprocedures: <p class = "jove_step"> PECAM colorimetrisch Lableing
- Primaire antilichaam incubatie: Drip ongeveer 100-200 ml primaire antilichaam-oplossing (1:200 muis monoklonaal antilichaam gebiotinyleerd CD31 antilichaam verdund in buffer (0,1% Saponine in PBS + 2% BSA)) op de top aan elk weefsel, zorg ervoor dat het hele weefsel is bedekt met antilichaam oplossing. Incubatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was weefsels met PBS +0,1% saponine gedurende 30 minuten.
- Secundair antilichaam incubatie: Drip secundair antilichaam-oplossing (VECTASTAIN Elite ABC oplossing van Vector Laboratories, een streptavidine-peroxidase tweede antilichaam-oplossing) op de top van de weefsels. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was weefsels met PBS +0,1% saponine gedurende 30 minuten.
- Incubeer weefsels met Vector Nova Rode gedurende 15 minuten. Dan stijgen weefsels met water.
- Mount dia's: Dip dia's in 95% ethanol 10 keer. Dompel dia's in 100% ethanol voor 2 minuten. Dompel de glaasjes in nog eens 100% ethanol, zodatlutie voor 2 minuten. Dan dompelen dia's in opeenvolgende 100% xyleen oplossingen voor elk 2 minuten. Laten drogen en weefsels bedekken met een dunne laag VectaMount en een dekglaasje.
PECAM fluorescentielabelling
- Primaire antilichaam incubatie: Drip ongeveer 100-200 ml primaire antilichaam-oplossing (1:200 muis monoklonaal antilichaam gebiotinyleerd CD31 antilichaam verdund in buffer (0,1% Saponine in PBS + 2% BSA)) op de top aan elk weefsel, zorg ervoor dat het hele weefsel is bedekt met antilichaam oplossing. Incubatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was weefsels met PBS +0,1% saponine gedurende 30 minuten.
- Secundair antilichaam incubatie. Druppel secundair antilichaam oplossing ((1:100 Streptavidine-CY3 verdund in antilichaam (0,1% saponine in PBS + 2% BSA)) op weefsels incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was weefsels met PBS +0,1% saponine gedurende 30 minuten.
- Mount dia's: Drip 50:50 PBS met glycerol op de top van de weefsels. Dekkenmet dekglas. Gebruik vervolgens nagellak om de kloof tussen dekglas en schuif af te sluiten.
5. Representatieve resultaten
Representatieve beelden rat mesenterium weefsels immunohistochemisch gemerkte PECAM weergegeven in figuur 3. PECAM etikettering identificeert alle types schepen langs de hiërarchie van de verbouwing microvasculaire netwerken en kan worden gebruikt om de angiogene statistieken op specifieke tijdstippen na stimulatie te kwantificeren. PECAM etikettering kunnen ook voor de bepaling van de arteriolen versus venulen. Het voeden arteriolen doorgaans vertonen kleinere diameters en langwerpige endotheelcellen morfologie in vergelijking met gepaarde venulen (figuur 4). Haarvaten en capillaire spruiten kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun schip diameter en relatieve positie in een netwerk. Typische kenmerken van remodeling netwerken zijn onder andere verhoogde capillaire kiemen, vaatdichtheid, gevasculariseerde gebied en venular tortuosheid. Kwantificering van verschillende angiogene metrics identificeert het tijdsverloop van de groei van het netwerk (figuur 5). Capillair ontspruit uit reeds bestaande schepen, pieken tussen dag 3 en dag 5 en keert terug naar de ongestimuleerde niveau op dag 10. Deze tijdelijke verhoging van de kiemen wordt gevolgd door stijgingen van de vasculaire dichtheid en gevasculariseerd gebied. Als bewijs voor de verbouwing van grotere schepen in dit model, het aantal arteriole en venule segmenten verhoogt ook over de tijd natuurlijk.
In ons laboratorium is dit model is gebruikt om cellulaire fenotypische veranderingen op specifieke tijdstip te identificeren tijdens deze verbouwing proces 10, 11. Bijvoorbeeld, klasse III β-tubuline identificeert pericyten langs angiogene schepen (figuur 6). In ongestimuleerde weefsels, klasse III β-tubuline expressie is zenuw specifiek. In tegenstelling, tijdens de piek van capillaire kiemen, is klasse III β-tubuline uitgedrukt door perivasculaire cellen. Dit typeresultaat belicht de toepassing van deze eenvoudige en robuuste angiogene model nieuwe celtypen bij het angiogene te identificeren.
Figuur 1. Beelden van de plastic podium pre-en post-modificatie. De pre-gemodificeerde fase is 100 mm petrischaal. Wijzigingen zijn onder andere een elliptische gat gesneden in het centrum en de daarop volgende toevoeging van klei of siliconen lijm aan de rand van het gat voor de oprichting van een verhoogde, glad oppervlak. Dit oppervlak zorgt voor een innerlijke grens die superfusie van de exteriorized mesenteriale ramen vergemakkelijkt. Schaalstaaf is 1 cm.
Figuur 2. Afbeelding van exteriorized mesenteriale regio. Mesenteriale ramen worden gedefinieerd als de dunne doorschijnende membranen tussen de slagader / ader paren het voeden van de dunne darm. Tijdens de uittredingduur, wordt de mesenteriale regio aangelegd en ondergedompeld in een zoutoplossing in een aangepaste petrischaal. Inert gele klei heeft een glad oppervlak voor het mesenterium worden getrokken door de voorgesneden gat. Schaalstaaf is 1 cm.
Figuur 3. Afbeeldingen slechts ter illustratie van de mesenteriale microvasculaire netwerken ongestimuleerde weefsels en weefsels op 3 en 10 dagen na de uittreding van het mesenterium. PECAM etikettering gewezen op de hiërarchie van microvasculaire netwerken, met inbegrip, arteriolen (A), venulen (V) en haarvaten (C). Bericht stimulatie, microvasculaire netwerken die worden vermeld een toename van de capillaire kiemen (pijlpunten) en vaatdichtheid. Schaal bar is 100 micrometer.
Figuur 4. Afbeeldingen slechts ter illustratie van de arteriole / venule paren binnen de volwassen rat mesenteriale microvasculaire netwerks. In beide beelden kan slagaders (A) worden onderscheiden van venules (V) op een kleinere diameter en relatief langwerpige endotheelcellen morfologie. Schaal bars zijn 20 urn.
Figuur 5. Vertegenwoordiger kwantificering van angiogene statistieken over het tijdsverloop van microvasculaire groei na mesenterium uittreding. A) Vasculaire oppervlakte per weefsel gebied. B) Aantal capillaire spruiten per vasculaire gebied. C) Totale vasculaire lengte per vasculaire gebied. * Staat voor significant verschil in vergelijking met niet gestimuleerde groep. Statistische vergelijkingen werden gemaakt met behulp van een One-Way ANOVA gevolgd door test Dunn's. (P <0,05). VN vertegenwoordigt ongestimuleerde.
Figuur 6. Vertegenwoordiger fluorescerende beelden van de mesenteriale microvasculaire netwerken ongestimuleerde weefsels en weefsels op 3 en 10dagen na de uittreding van het mesenterium. Immunofluorescentie PECAM etikettering (rood) geeft endotheelcellen, en klasse III β-tubuline etikettering (groen) geeft zenuwen (pijlpunten) en perivasculaire cellen (pijlen). Perivasculaire cellen tijdelijk upregulate klasse III β-tubuline tijdens capillaire kiemen. In ongestimuleerde microvasculaire netwerken, klasse III β-tubuline is zenuw specifiek en niet te identificeren perivasculaire cellen. 3 dagen na stimulatie, klasse III β-tubuline labelt positief perivasculaire cellen langs de haarvaten. Per dag 10, klasse III β-tubuline expressie patroon begint om terug te keren naar de ongestimuleerde scenario. Schaal bar is 50 urn.
Figuur 7. Afbeeldingen ondersteuning van de haalbaarheid van het bijhouden van gelabelde lokaal aangebrachte cellen tijdens microvasculaire groei van het netwerk gestimuleerd door het mesenterium uittreding. De cellen werden superfused meer dan mesenteric ramen tijdens de 20 minuten uittreding periode. 1 dag na de operatie, DII gelabelde cellen (rood) werden waargenomen in de dame brandvlak met PECAM positieve haarvaten (groen). A, B) Voorbeelden van DII gelabelde beenmergcellen exposeren rond en langwerpig morfologie. In sommige gevallen (pijlen) cellen werden verlengd langs microvaatjes. C) Voorbeeld van een cluster van DII gelabelde mesenchymale stamcellen in de buurt van de top van een capillair spruit (pijl). Schaal staven 50 pm (A) en 20 pm (B, C).
Discussion
De uittreding model werd gemeld in 2006 en is een bewerking van eerdere mechanische schade rat mesenterium modellen van angiogenese 4-7 en verkrijgt u hetzelfde resultaat dat de gevestigde ip injectie modellen die gebruik maken van de rat mesenterium 9. De 20 minuten uittreding tijd werd experimenteel bepaald om een robuuste angiogene reactie te produceren. Hoewel deze periode kan worden gevarieerd, het wordt toch mogelijk voor de lokale toepassing van angiogene-remmers 4 voor mechanistische studies en directe toepassing van de exogene cellen voor cellijn studies. Haalbaarheid van de cel worden opgenomen in verbouwing mesenteriale weefsel wordt ondersteund door voorbereidend onderzoek in ons laboratorium met behulp van gelabelde beenmerg cellen en mesenchymale stamcellen (Figuur 7), en door het succes van onderzoek naar het lot van de menselijke vet-afgeleide stromale cellen injectie ip 14 . In ons laboratorium hebben we gebruik gemaakt van deze model pericyte phen te identificerenotypic veranderingen in het tijdsverloop van de angiogene respons 10 en om de angiogene potentiële beoordelen tijdens pathologische omstandigheden, zoals hoge bloeddruk 12. De angiogene respons en cel fenotype veranderingen die gepaard gaan met dit model kan ook worden waargenomen in andere rat mesenteriale angiogene modellen, waaronder chronische hypoxie blootstelling 10, 11.
Een beperking van de uittreding model is dat de exacte gang mechanismen van angiogenese onbekend zijn. Uittreding van het mesenterium is gekoppeld aan mestcel degranulatie en verhoogde histamine niveaus 6, maar verder onderzoek is nodig om meer inzicht te krijgen. De angiogene stimulans is ongetwijfeld multifactoriële, het produceren van een robuuste remodeling reactie over de hiërarchie van een microvasculaire netwerk. Terwijl de onbekende mechanismen blijven een belangrijke kritiek op dit model, de reproduceerbaarheid en eenvoud maken het aantrekkelijk voor het identificeren van cellulaire dynamiek INVOLved in de inherent complexe capillaire kiemen proces. De reproduceerbaarheid van het model wordt ondersteund door een vergelijkbare angiogene statistieken over het tijdsverloop van microvasculaire groei van het netwerk over meerdere ratten stammen (mannelijke Wistar en vrouwelijke Sprague-Dawley) in eerder gepubliceerde studies in ons laboratorium 10, 12. Aangezien de meerderheid van de volwassen rat mesenteriale weefsels zijn gevasculariseerd, het model maakt het ook mogelijk om meerdere weefsels worden onderzocht per dier. Helaas is dit model is uiteraard van toepassing op genetische muismodellen als muis mesenteriale ramen hebben minder inheemse vascularisatie en, in onze ervaring, vaak ontbreekt waarneembaar vertakking netwerken. Toekomstige toepassingen zijn onder meer het onderzoek van het schip functionaliteit tijdens angiogenese met behulp van intra-vitale microscopie op specifieke tijdstippen en het onderzoek van gerelateerde cellulaire dynamiek die betrokken zijn bij lymfangiogenese en neurogenese. Hoewel de omvang van de inheemse vascularisatie per mesenteriale raam lijkt te zijn roughly evenredig met de leeftijd, hebben we waargenomen vertakking microvasculaire netwerken in mannelijke Wistar ratten zo jong als 4-5 weken oud zijn. Deze waarnemingen suggereren dat de uittreding model ook kan worden toegepast op de angiogene verschillen tussen de leeftijden te vergelijken.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Raad van Regenten van de staat Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) en de Tulane Hypertensie en Nier Center of Excellence gefinancierd door NIH-subsidie P20RR017659-08 (PI : L. Gabriel Navar).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12"x12" Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge;0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Graefe Forcep | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| 4-0 suture | Ethicon Inc. | 699G | (1.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament |
| 5-0 suture | Ethicon Inc. | 8556 | (1.0 metric) PROLENE Polyprolene Suture Blue Monofilament |
| 7-0 suture | Ethicon Inc. | 1647G | (0.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | Tip Width:0.6mm Clamping Length:5mm Length:9cm Straight tip |
| Castroviejo Needle Holder | Fine Science Tools | 12565-14 | Tip Shape:Straight Tip Width:1.5mm Clamping Length:10mm Scissors:No Lock:Yes Length:14cm Serrated:Yes |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | Beveled Ridge, Slippable |
| Table of Specific Surgical Materials and Tools. | |||
| Beuthanasia | Merck & Co. | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | MWI #: 009307 | Anased 100 mg/ml (Ordered from MWI Veterinary Supply) |
| Saline | Hospira Inc. | 94-217-JT | |
| PBS | Sigma-Aldrich | 011M8207 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | BCBB4080 | |
| PECAM (CD31) | BD Biosciences | 553371 | |
| Streptavidin-CY3 | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 096555 | |
| VECTASTAIN Elite ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Vector Nova Red | Vector Laboratories | SK-4800 | |
| VectaMount | Vector Laboratories | H-500 | |
| Table of Specific Reagents | |||
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407, 249-257 (2000).
- le Noble, F. A., Stassen, F. R., Hacking, W. J., Struijker Boudier, H. A. Angiogenesis and hypertension. J. Hypertens. 16, 1563-1572 (1998).
- Peirce, S. M., Skalak, T. C. Microvascular remodeling: a complex continuum spanning angiogenesis to arteriogenesis. Microcirculation. 10, 99-111 (2003).
- Anderson, C. R., Ponce, A. M., Price, R. J. Immunohistochemical identification of an extracellular matrix scaffold that microguides capillary sprouting in vivo. J. Histochem. Cytochem. 52, 1063-1072 (2004).
- Ponce, A. M., Price, R. J. Angiogenic stimulus determines the positioning of pericytes within capillary sprouts in vivo. Microvasc. Res. 65, 45-48 (2003).
- Franzen, L., Ghassemifar, R., Malcherek, P. Experimental mast cell activation improves connective tissue repair in the perforated rat mesentery. Agents Actions. 33, 371-377 (1991).
- Anderson, C. R., Hastings, N. E., Blackman, B. R., Price, R. J. Capillary sprout endothelial cells exhibit a CD36 low phenotype: regulation by shear stress and vascular endothelial growth factor-induced mechanism for attenuating anti-proliferative thrombospondin-1 signaling. Am. J. Pathol. 173, 1220-1228 (2008).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
- Norrby, K. C. Rat Mesentery Angiogenesis Assay. J. Vis. Exp. (52), e3078 (2011).
- Murfee, W. L., Rehorn, M. R., Peirce, S. M., Skalak, T. C. Perivascular cells along venules upregulate NG2 expression during microvascular remodeling. Microcirculation. 13, 261-273 (2006).
- Stapor, C. P., Murfee, L. W. Identification of class III β-tubulin as a marker of angiogenic perivascular cells. Microvascular Research. , Forthcoming (2011).
- Yang, M., Aragon, M., Murfee, W. L. Angiogenesis in Mesenteric Microvascular Networks from Spontaneously Hypertensive Versus Normotensive Rats. Microcirculation. , (2011).
- Robichaux, J. L. Lymphatic/Blood endothelial cell connections at the capillary level in adult rat mesentery. Anat. Rec. (Hoboken). 293, 1629-1638 (2010).
- Amos, P. J. IFATS collection: The role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype. Stem Cells. 26, 2682-2690 (2008).
