Denne artikel beskriver en simpel model for at stimulere angiogenese hos rotter mesenterium. Model frembringer dramatiske stigninger i kapillær spire, vaskulær område og vaskulær densitet over en relativ kort tidsforløb i et væv, der tillader en face visualisering af hele mikrovaskulære net ned til en enkelt celle-niveau.
Microvacular netværk vækst og remodellering er kritiske aspekter af sårheling, inflammation, diabetisk retinopati, tumorvækst og andre sygdomstilstande 1, 2. Netværk vækst er almindeligt tilskrives angiogenese, defineret som væksten af nye fartøjer fra allerede eksisterende fartøjer. Den angiogene proces er også direkte forbundet med arteriogenesis, defineret som kapillar erhvervelse af en perivaskulær celle belægning og skib udvidelsen. Det er overflødigt at sige, angiogenese er kompleks og involverer flere spillere på det cellulære og molekylære niveau 3. Forstå hvordan et mikrovaskulære netværket vokser kræver en identificering af de rumlige og tidslige dynamik langs hierarki af et netværk over tidsforløbet af angiogenese. Denne information er kritisk for udviklingen af terapier rettet mod at manipulere karvækst.
Den eksteriorisering model beskrives i denne artikel er en simpel, reproducerbar model til stimulating angiogenese hos rotter mesenteriet. Det blev tilpasset fra sårhelende modeller i rotter mesenteriet 4-7, og er et alternativ til at stimulere angiogenese i mesenteriet via IP injektion af pro-angiogeniske midler 8, 9. Den eksteriorisering model er attraktiv, fordi den kræver minimal kirurgisk indgreb og frembringer dramatiske, reproducerbare stigninger i kapillarspirer, vaskulær areal og vaskulær densitet over en relativt kort tidsforløb i et væv, der tillader den todimensionale visualisering af hele mikrovaskulære net ned til en enkelt celleniveau. Den stimulerede vækst afspejler naturlige angiogene reaktioner i et fysiologisk miljø uden indblanding af udenlandske angiogene molekyler. Anvendelse immunohistokemiske mærkningsmetoder, er denne model vist sig særdeles nyttige til at identificere hidtil ukendte cellulære begivenheder involveret i angiogenese. Undersøgere kan let korrelere de angiogene målinger under tidsforløbet for remodellering med tiden specific dynamik, såsom cellulære fænotypiske ændringer eller cellulære interaktioner 4, 5, 7, 10, 11.
Den eksteriorisering model blev rapporteret i 2006 og er tilpasset fra tidligere mekanisk skade rotte mesenterium modeller for angiogenese 4-7 og frembringer lignende resultater veletablerede IP-injektion modeller, der udnytter rotte mesenteriet 9. Den 20 minutter eksteriorisering tid blev eksperimentelt bestemt til frembringelse af en robust angiogen respons. Mens dette tidsrum kan varieres, men ikke tillader lokal påføring af angiogene inhibitorer 4 for mekanistiske undersøgelser og direkte anvendelse af exogene celler for cellelinie undersøgelser. Gennemførligheden af celle inkorporering i remodellering mesenteriske væv understøttes af indledende forsøg i vores laboratorium med præ-mærkede knoglemarvsceller og mesenchymale stamceller (fig. 7), og ved succes undersøge skæbne af human adipøst afledte stromaceller injektion ip 14 . I vores laboratorium har vi brugt denne model til at identificere pericyte phenotypic ændringer over tidsforløbet af den angiogene respons 10 og vurdere den angiogene potentiale under patologiske tilstande, såsom hypertension 12. Den angiogene respons og cellefænotype ændringer forbundet med denne model også kan observeres i andre rotte mesenteriske angiogene modeller, herunder kronisk hypoxi eksponering 10, 11.
En begrænsning af eksteriorisering model er, at de nøjagtige udloesningsmekanismer af angiogenese er ukendte. Eksteriorisering af mesenterium har været forbundet med mastcelledegranulation og øgede histaminindhold 6, men yderligere undersøgelser er påkrævet for at få mere indsigt. Den angiogene stimulus er utvivlsomt multi-faktoriel, der producerer en robust remodeling svar på tværs af hierarkiet i en mikrovaskulær netværk. Mens de ukendte mekanismer fortsat en væsentlig kritik af denne model, dens reproducerbarhed og enkelhed gør det attraktivt for at identificere cellulære dynamik involat the i sagens natur komplekset kapillære spiringsproces. Reproducerbarheden af modellen understøttes af sammenlignelige angiogene metrikker over tidsforløbet af mikrovaskulære net vækst på tværs af flere rottestammer (Wistar og Sprague-Dawley) med tidligere publicerede undersøgelser fra vores laboratorium 10, 12. Idet hovedparten af voksne rotter mesenteriske væv er vaskulariseret, modellen også giver mulighed for flere væv, der skal undersøges for hvert dyr. Desværre er denne model ikke er åbenbart for genetiske musemodeller som mus mesenteriske vinduer har mindre indfødte vaskularisering, og i vores erfaring, ofte mangler observerbare forgrenede netværk. Fremtidige applikationer omfatter undersøgelse af skibet funktionalitet i løbet af angiogenese ved hjælp af intra-vital mikroskopi på bestemte tidspunkter og undersøgelse af relaterede cellulære dynamik involveret i lymphangiogenesis og neurogenese. Selvom omfanget af native vaskularisering pr mesenteriske vindue synes at være rutinemæsghly proportionalt med alderen, har vi observeret forgrening mikrovaskulære netværk i Wistar rotter som unge som 4-5 uger gammel. Disse observationer antyder, at eksteriorisering model også kunne anvendes til at sammenligne de angiogene forskelle i alder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af bestyrelsen for Regents i staten Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) og Tulane Hypertension og Renal Center of Excellence finansieret af NIH tilskud P20RR017659-08 (PI : L. Gabriel Navar).
Name | Company | Catalogue Number | Additional Comments |
Drape | Cardinal Health | 4012 | 12″x12″ Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge;0.25mm Tip Width, 4 1/2″ Overall Length |
Graefe Forcep | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4″ Length |
Graefe Forcep | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4″ Length |
4-0 suture | ETHICON | 699G | (1.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament |
5-0 suture | ETHICON | 8556 | (1.0 metric) PROLENE Polyprolene Suture Blue Monofilament |
7-0 suture | ETHICON | 1647G | (0.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament |
Castroviejo Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | Tip Width:0.6mm Clamping Length:5mm Length:9cm Straight tip |
Castroviejo Needle Holder | Fine Science Tools | 12565-14 | Tip Shape:Straight Tip Width:1.5mm Clamping Length:10mm Scissors:No Lock:Yes Length:14cm Serrated:Yes |
Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4″ Length |
Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | Beveled Ridge, Slippable |
Table of Specific Surgical Materials and Tools.
Name | Company | Catalogue Number | Additional Comments |
Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) |
MWI #: 009307 | Anased 100 mg/ml |
Saline | Hospira Inc. | 94-217-JT | |
PBS | SIGMA | 011M8207 | |
Saponin | Sigma | BCBB4080 | |
PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 553371 | |
Streptavidin-CY3 | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
BSA | Jackson ImmunoResearch | 096555 | |
VECTASTAIN Elite ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | |
Vector Nova Red | Vector Laboratories | SK-4800 | |
VectaMount | Vector Laboratories | H-500 |
Table of Specific Reagents