Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Die Verwendung von pharmakologischen fMRT-Herausforderung in der präklinischen Forschung: Anwendung auf die 5-HT-System

doi: 10.3791/3956 Published: April 25, 2012

Summary

Das Ziel dieser Technik ist es, Serotonin (5-HT) Neurotransmitter-Funktion im Live-und frei atmenden Tier mit pharmakologische Kernspintomographie (phMRI) und einer intravenösen Herausforderung mit einem selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI), Fluoxetin zu beurteilen.

Abstract

Pharmakologische MRT (phMRI) ist eine neue und vielversprechende Methode, um die Wirkung von Substanzen auf die Gehirnfunktion, die letztlich zur zugrunde liegenden neurobiologischen Mechanismen, die hinter Arzneimittelwirkung und Neurotransmitter-Störungen, wie Depressionen und ADHS entwirren kann studieren. Wie die meisten der bildgebenden Verfahren (PET, SPECT, CT) stellt es ein Fortschritt in der Erforschung der Erkrankungen des Gehirns und der damit verbundenen Funktion von Neurotransmitter-Bahnen in einer nicht-invasive Weise hinsichtlich des gesamten neuronalen Konnektivität. Darüber hinaus bietet auch die ideale Werkzeug für die Übersetzung mit der klinischen Prüfung. MRT, während immer noch hinter in der molekularen Bildgebung Strategien im Vergleich zu PET und SPECT, hat den großen Vorteil, eine hohe räumliche Auflösung und keinen Bedarf für die Injektion eines Kontrastmittels-Agenten oder radioaktiv markierten Moleküle haben, um so dem wiederholten Exposition gegenüber ionisierender Strahlung . Funktionelle MRT (fMRT) wird ausführlich in der Forschung und klinischen Umfeld eingesetzt, wo es ist gllgemein mit einer psycho-motorische Aufgabe kombiniert. phMRI ist eine Adaption von fMRT ermöglicht die Untersuchung von einem bestimmten Neurotransmitter-System, wie zB Serotonin (5-HT), die unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen nach der Aktivierung über die Verabreichung eines spezifischen Herausforderungen Droge.

Das Ziel der hier beschriebenen Verfahren ist es, Gehirn 5-HT-Funktion in frei atmenden Tieren zu beurteilen. Durch Einspruch gegen den 5-HT-System zu erwerben und gleichzeitig funktionelle MR-Bilder im Laufe der Zeit kann die Reaktion des Gehirns auf diese Herausforderung visualisiert werden. Mehrere Studien an Tieren haben bereits gezeigt, dass Medikamenten-induzierten Anstieg der extrazelluläre Konzentration von z. B. 5-HT (Trennmittel, selektive Re-uptake-Blocker etc.) Region-spezifische Änderungen in Blutoxygenierung Ebene evozieren abhängiger (BOLD) MRI-Signale (Signal durch zu einer Veränderung der oxygenierten / sauerstoffarmes Hämoglobin, die während Hirnaktivierung durch eine Erhöhung der Blutversorgung, um den Sauerstoff zu versorgen und glucose den anspruchsvollen Neuronen), das einen Index von Neurotransmitter-Funktion. Es wurde auch gezeigt, dass diese Effekte durch Behandlungen, die Abnahme 5-HT Verfügbarkeit 16,13,18,7 umgekehrt werden kann. Bei erwachsenen Ratten haben BOLD-Signal Änderungen nach akuter SSRI Verwaltung in mehreren 5-HT verwandten Hirnregionen, das heisst kortikalen Arealen, Hippocampus, Thalamus und Hypothalamus 9,16,15 beschrieben worden. Die Stimulation des 5-HT-System und seine Antwort auf diese Herausforderung kann somit als Maß für seine Funktion in Tieren und Menschen 2,11 verwendet werden.

Protocol

Vorbereitung für Tier in vivo MR-Bildgebung

1. Chirurgische Kanülierung

  1. Anesthetize der Ratte (Wistar Ratten, 200-300 g) mit Isofluran (5% Induktion und dann reduziert auf 1,5 bis 2% für die Aufrechterhaltung von Narkosen bei Tier-und Scan-Vorbereitung) in der medizinischen Luft gegeben (21% O 2, BOC UK) . Stellen Sie sicher, dass das Tier betäubt ist gut und zeigt keine Reaktion auf einen Zeh Prise. Die Arteria und Vena femoralis sind für Blut-Gas-und Blutdruckmessungen und der Verabreichung des Arzneimittels Herausforderung beziehungsweise eine Kanüle eingeführt. Während des chirurgischen Eingriffs wird der Körper des Tieres Temperatur überwacht und aufrechterhalten durch eine rektale Sonde und einer Wärmedecke (Harvard Apparatus).
  2. Die narkotisierten Tier wird auf einem Pad Erwärmung unter einem Binokular in Rückenlage positioniert. Rasieren Sie die Mitte der Oberschenkel-Bereich und Tupfer die Haut mit Alkohol. Machen Sie einen 2 cm langen Hautschnitt entlang der Falte durch den Bauch und am rechten Oberschenkel gebildet.Stumpfe Dissektion der Adduktoren wird verwendet, um die femorale Arterie, Vene und den N. femoralis zu visualisieren. Trennen Sie sorgfältig die Gefäße.
  3. Sanft binden einen Seidenfaden vollständig um das distale Ende des Gefäßes und stellen eine weitere Bindung mit der Hälfte eines chirurgischen Knoten lose in der proximalen Seite. Anwendung von Zugkraft auf beide Ligaturen, um den Blutfluss in der verbleibenden mittleren Teil des Behälters zwischen den Ligaturen ausgesetzt zu verschließen. Einen kleinen Einschnitt von etwa einem Drittel der Behälterumfang in diesem Teil des Gefäßes zu ermöglichen Einführen einer Kanüle PE-50 (0,54 mm Innendurchmesser und 0,96 mm für Außendurchmesser bei erwachsenen männlichen Ratten, sonst 0,40 mm ID und 0,80 mm ED) in das Gefäß.
  4. Die Kanüle sollte mehreren mm (mindestens 5) in das Gefäß eingeführt werden. Wenn in das Lumen, flacher eine geringe Menge an heparinisierter Kochsalzlösung (15 IE / ml) durch das Gefäß, um eine Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern. Das proximale Seide Schleife ist auch völlig, um die Kanüle zu fixieren ligiert. Riederholen Sie diesen Vorgang für den zweiten Behälter. Kleben Sie die Haut mit Hilfe eines Vetbond Gewebekleber (3M UK plc, Bracknell, UK), wenn beide Kanülen an ihrem Platz sind. Siehe Abbildung 1 für eine exakte Platzierung der Kanülen.
  5. Platzieren Sie das Tier in einer MR-kompatiblen stereotaktischen Bett (M2M Imaging Corp, USA) in Bauchlage. Pflegen Sie den Kopf des Tieres durch die Einfügung von Ohr Bars und einer Zahn-Bar. An diesem Punkt kann das Tier in der MRI-Scanner zum Abbilden abgegeben werden. Das Tier bleibt betäubt und ist frei atmenden über den gesamten Imaging-Verfahren.

2. Überwachung

Während der gesamten Imaging-Verfahren, sollten mehrere physiologischen Reaktionen ständig überwacht werden und so konstant wie möglich gehalten werden. Dies ist wichtig, da diese Reaktionen sehr unterschiedlich sein kann im gleichen Zeitfenster wie die phMRI Signal und auch Einfluss auf das Signal von Interesse. Es ist auch wichtig, da das Tier in der ma platziert werdengnet und ist deshalb aus den Augen und entziehen sich der Standard-Checks der Narkosetiefe (z. B. Zeh Prise), für eine angemessene Narkosetiefe. Zusätzlich, da viele Medikamente Herz-Kreislauf-Parameter wie Blutdruck zu verändern, ist eine Messung dieser kritischen, um sicherzustellen, wegen der globalen physiologischen Wirkungen des Arzneimittels die Aktion in den phMRI Daten ergriffen werden können. Siehe auch Abschnitt 4 für die Baseline-Werte und die zu erwartenden Reaktionen auf die Infusion von 5 mg / kg Fluoxetin.

  1. Die Körpertemperatur wurde bei 37 ± 1,5 ° C durch einen Heizofen (SA Instruments, New York, USA). Seien Sie sich bewusst, dass der MR-Bildgebung kann die Temperaturmessung beeinflussen, prüfen Sie dies mit Ihrem eigenen System.
  2. Überwachen und Aufzeichnen des Tieres Atemfrequenz mittels eines Atem-Manschette, die mit Drucksensor (SA Instruments, New York, USA).
  3. Notieren invasiven arteriellen Blutdrucks mit einem Druckwandler (TSD104A, Biopac Systems Corp, USA) und in regelmäßigen Abständen ein Rücktrittd arteriellen Blut Gasproben (Rapidlab, Siemens diagnostischen) über den kanülierten Femoralarterie analysieren während der Bildgebung zu arteriellen pCO 2 und der Sauerstoff-Partialdruck (pO 2) zu überwachen.
  4. Verwenden Sie den kanülierten femoralis als Haupt-Infusionsleitung für die pharmakologische Herausforderung (Fluoxetin (Fluoxetinhydrochlorid von Sigma-Aldrich, UK)-Lösung, 5 mg / kg, in Kochsalzlösung gelöst).

In-vivo-Bildgebung

Eine schematische Darstellung der fMRT Versuchsaufbau ist in Abbildung 2 dargestellt.

3. Bildgebungsparameter

  1. Sobald das Tier im Inneren des Scanners gelegt und sind weiterhin stabil physiologischen Reaktionen zeigen, können bildgebende starten. In unseren Untersuchungen verwendeten wir eine 4,7 T MRT-System kleines Tier (Agilent Technologies) mit einem zylindrischen Quadratur Sende / Empfangs-HF-Spule mit 72 mm Innendurchmesser (M2M Imaging Corp, USA). Machen Sie eine drei ebenen Scout Bild auf P stellen richtigOSITION das Gehirn in der Mitte des MRI Sichtfeld und mit lokalisierten Shim Korrektur (FastMap Sequenz), um das Magnetfeld Homogenität im Gehirn verbessern.
  2. Für jedes Tier, zunächst einen T2-gewichteten Bild anatomische Volumen für die Registrierung und Segmentierung Zwecke. Wir verwendeten eine Turbo-Spin-Echo-Sequenz mit Echo Zuglänge = 8; Matrix size = 256 x 256, FOV = 50 x 50 mm 2; mit verschachtelten Erwerb von 30 zusammenhängenden koronalen Scheiben mit 1 mm Dicke, zentriert 8 mm kaudal bis zum hinteren Rand der Riechkolben; Durchschnitte = 4; TR / TE = 5112/60 ms.
  3. Achten Sie darauf, das Tier seiner physiologischen Reaktionen sind konstant, bevor Sie den Scan-phMRI. Für die Zeitreihen Erwerb verwendeten wir die gleiche T2-gewichteten Turbo-Spin-Echo-Sequenz mit Echo Zuglänge = 16; Matrix size = 128 x 128, mit verschachtelten Erwerb von 20 zusammenhängenden Scheiben mit 1 mm Dicke an derselben Position zentriert; TR / TE = 4915/60 ms. Insgesamt erwarben wir 32 Punkte mit einem aÜ bernahme der Zeit von 158 Sekunden pro Zeitreihen Volumen und insgesamt Scan-Zeit von 84 min. Der erste Band wird als "Dummy-Scan" verwendet, um T1 Sättigungseffekte anzusprechen und nicht in der Datenanalyse verwendet. Andere Sequenzen, wie fMRI Gradientenecho oder Echo-Planar-Bildgebung (EPI)-Sequenzen können ebenfalls verwendet werden. Achten Sie darauf, um das Signal der Stabilität Ihrer Sequenz der Wahl vor Beginn des Experiments zu beurteilen.
  4. Erwerben Sie eine Reihe von Baseline-Bände, vor Verabreichung der Medikamente Herausforderung. Wir schlagen vor, mindestens 10 Minuten von Baseline-Übernahme unter stabilen Bedingungen. Starten Sie die Infusion an genau der gleichen Zeit für alle Tiere. In unserem Protokoll, begannen wir Verabreichung zu Beginn der 9. Band (nach etwa 21 min Baseline-Scanning). Nach der Infusion fortgesetzt Bildaufnahme für weitere 60 Minuten (32 Bände insgesamt). Achten Sie darauf, die nach der Infusion lang genug ist, um Veränderungen sichtbar zu machen und Steady-State oder das Wiederaufleben des Signals zu erreichen, abhängig von Ihrer Forschung questiauf und Ihre Wahl der Droge Herausforderung.
  5. Bei der Bildaufnahme beendet ist, entfernen Sie das Tier aus dem Scanner. Eine abschließende Blut-Gas-Messung, um die Stabilität der Blutgasparameter zu gewährleisten und die Auswertung der Wirkung von Medikamenten auf Grundlagen der Physiologie zu ermöglichen.

Datenverarbeitung

4. Physiologischen Reaktionen

Erwartete physiologischen Reaktionen auf die Herausforderung, sind abhängig von der gewählten Droge. Im Folgenden werden allgemein anerkannten Ausgangswerte (von erwachsenen männlichen Ratten) und die erwarteten Antworten auf die iv-Infusion von 5 mg / kg Fluoxetin gegeben.

  1. Atemfrequenz sollte bei 45 bis 75 Atemzüge / Minute stabil. Die pharmakologische Herausforderung von Fluoxetin induziert eine kurze Anstiegszeit (15-20%) in der Atemfrequenz.
  2. Der Blutdruck sollte konstant sein und zwischen 100 bis 150 mmHg (Biopac Systems Corp, Goweta, USA). Die Fluoxetin Herausforderung induziert einen kurzen, aber steilen Abfall von ca. 20% des arteriellen Blutdrucks.Dies sollte innerhalb von 5-10 Minuten zu erholen. Dies ist in 3 gezeigt.
  3. Blutgaswerte sollte stabil sein (messen mindestens zweimal) und in den folgenden Bereichen vor dem Starten des Scan-phMRI: pCO 2, 35-45 mmHg; pO 2, 80-130 mmHg; pH-Wert, 7,35 bis 7,45. Überprüfen Sie immer wieder diese Werte nach dem Scannen zu sehen, ob das Tier blieb stabil und bis zur Auswertung der Wirkung von Medikamenten auf Grundlagen der Physiologie zu ermöglichen. Hohe pCO 2-Werte wird induzieren Gefäßerweiterung und wird somit nicht zu sehen BOLD-Signal ändert.
  4. Stellen Sie sicher, dass das Tier unter einer kontinuierlichen und konstanten Niveau der Anästhesie ist (2 ± 0,25%; höheren Ebenen können Depressionen von zerebrovaskulären Reaktivität und unteren unzureichende Betäubung und damit Bewegung verursachen), vor dem Starten des Scan-und phMRI wichtiger ist, zu vermeiden Anpassungen bei den Anästhesie-Regime (z. B.% Isofluran und / oder Gasfluss) während der funktionellen Bildaufnahme, da dies auch Auswirkungen auf die BOLD-Signal.

Hier beschreiben wir einige Schritte in der Vorverarbeitung der MR-Daten, um die Daten für statistische Untersuchungen optimalisieren. Wir erwähnen die Werkzeuge, die in unserem Labor verwendet werden, aber viele verschiedene Tools zur Verfügung stehen.

5,1 Datenaufbereitung

  1. Setzen Sie die RAW-Bilder in der richtigen Dateiformat für die MRI-Analyse-Software, die Sie verwenden möchten (oder NIfTI1.1 Analyze7.5 Format für FSL-Programme). Mehrere offene Datei-Konverter-Programme sind online verfügbar. Je nach verwendetem Scanner, kann es notwendig sein, zunächst eine 3D-Konstruktion (anatomische Scan) oder 4D (phMRI Scan) Image aller separaten 2D-Scheiben. Dies kann unter Verwendung eines Bildverarbeitungsprogramms, wie ImageJ 1 ist.
  2. Um die Kompatibilität mit Analyse-Algorithmen für den Einsatz mit menschlichen Daten (zB Programme FSL) entworfen zu gewährleisten, hat Voxelgröße um den Faktor 10 (dies kann auch mit zum Beispiel ImageJ werden) multipliziert werden. In unserer Studie führte dies zu einer Voxelgröße von 3,91 x 3,91 x 10 mm 3.
  3. Optisch überprüfen Sie Ihre Bilder für Unregelmäßigkeiten bei der Orientierung, Artefakte und Bewegung. Achten Sie darauf, Scans mit klaren Artefakte oder übermäßige Bewegung in Ihre Analysen verwenden, wie sie verzerren werden Sie Ergebnisse.
  4. Ausrichtung aller Scans sollte ähnlich zwischen den anatomischen und funktionellen Bilder und in Übereinstimmung mit der verwendeten Referenz Gehirn. In unserer Studie haben wir die stereotaktische Rattenhirn Vorlage von Schwarz 14 beschrieben. Das FSL-Befehl fslswapdim kann für eine Neuorientierung genutzt werden.

5,2 Bewegungskorrektur

  1. Um für eventuelle Bewegungsartefakte in der 4D Zeitreihen zu korrigieren, nutzten wir die Bewegungskorrektur Werkzeug McFlirt (Motion Correction mit FMRIB der Linear Image Registration Tool, Teil FMRIB die Software-Bibliothek, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT ist ein intra-modale Bewegungskorrektur Werkzeug designed für den Einsatz auf fMRI-Zeitreihen und auf der Basis-Optimierung und Eintragung in FLIRT Techniken verwendet, ein voll automatisiertes Werkzeug für lineare (affine) intermodalen Gehirn Bildregistrierung. Immer darauf zu überprüfen, ob das Ergebnis zufriedenstellend ist.

5,3 Gehirn-Segmentierung

  1. Löschen Sie alle nicht-Hirngewebe von einem Bild des ganzen Kopfes sowohl für die 4D Zeitreihe als die 3D-anatomische Bild. Dafür verwendeten wir den FSL-Tool BET (Brain Extraction Tool v. 2.1, Teil FMRIB die Software-Bibliothek, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). Die Standardeinstellungen sind für die Verwendung mit menschlichen Gehirnen entwickelt und sind daher nicht ideal für Rattenhirn. Wir benutzten die folgenden Parameter: anteilige Intensität Schwelle, f = 1,0; Vertical Gradient in anteilige Intensität Schwelle, g = 0,1; und Kopf Radius (in mm), r = 175 für die meisten Tiere. Wenn nötig, können Sie diese Werte pro Fach zu optimieren.

6. Daten Analysis

Tor der statistischen Analyse der MR-Daten ist, die Voxel, die zusätzliche Varianz zurückzuführen auf das Medikament Herausforderung in einer statistisch zuverlässige Weise aufweisen bestimmen. Verschiedene methodische Ansätze gibt es für diese, auch als zählbar Software-Pakete. Die getroffene Auswahl ist abhängig von der Verfügbarkeit von Software und Kenntnisse / Erfahrungen in Ihr Labor und Ihre spezifische Fragestellung. Hier geben wir eine Methode vorgeschlagen, wie es in unserem Labor verwendet.

6,1

  1. Vor der Analyse der MRI-Daten, zu bestimmen einem allgemeinen linearen Modell (GLM), an dem die Daten versehen sein. Dies kann eine einfache quadratische Ein-Aus-Modell (aus für Drogen-und Pre-on für Post-Arzneimittelinfusion) oder ein bestimmtes Modell auf den Daten basiert. Wir haben das Programm Stimulieren Sie 21, um eine Daten-basierte GLM-Modell zu bestimmen.
  2. Führen Sie eine Zwei-Stichproben t-Test (zum Beispiel in Stimulieren) auf allen Bänden Baseline vs alle Post-Herausforderung Bände. Optional lassen out das erste Volumen (en) und das Volumen, in dem die Herausforderung gegeben wird, da die nicht darstellen können Steady-State-Bildgebung. Anschließend diskriminieren alle Voxel mit mehr als eine bestimmte% Veränderung zum Ausgangswert. Wir benutzten alle Voxel mit mehr als 1% Veränderung.
  3. Als nächstes Durchschnitt der zeitliche Verlauf in all diesen Voxeln, die bereits gibt Ihnen einen Eindruck von der Form des Modells. Auf diese Weise kann bestimmt werden, wenn die Herausforderung 1) eine sofortige oder verzögerte Wirkung, 2) wenn der Effekt ein Plateau und / oder Spitzen und 3) ob oder wann die Wirkung wieder abnimmt während des Zeitverlaufs der erreicht werden zu scannen. Beispiele sind in 4A und 4B gezeigt.

6,2

Der nächste Schritt ist dann, um statistisch testen Sie die RAW-4D Zeitreihen Bild jedes Tieres gegenüber dem Vorjahr festgestellt GLM-Modell. Hierzu verwendeten wir das Programm FSL FEAT (fMRI Expert Analysis Tool, v5.98) 17,24. Jedoch sind auch andere fMRI Analyse-Tools AvailaBLE als auch. Im Rahmen der Analyse-Werkzeug, eine erste Analyse auf eingerichtet werden. Dies erfordert folgende Schritte:

  1. Achten Sie darauf, die gleichen Einstellungen für jedes Tier zu verwenden. Sie können wählen, um die ersten (zwei) Bänden vor der Analyse zu löschen, da Steady-state-Bildgebung kann noch nicht an diesem Punkt zu erreichen. Stellen Sie den TR, das ist die Zeit (in Sekunden) zwischen dem Beginn eines jeden aufeinanderfolgenden Volumen. Da Sie auf Effekte, die den gesamten Scan-Zeit dauern könnte suchen, gibt es keine Notwendigkeit, ein hohes oder Tiefpassfilter gesetzt.
  2. Räumlich glatt die Daten, um Lärm zu reduzieren und zur Verbesserung der Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Wir wählten eine FWHM-Kernel von 8 mm.
  3. Jetzt starten Sie das gewünschte Modell GLM auf Ihre Daten. Das ist Ihre wichtigste erklärende Variable (EV), dh die Wellenform Testen Sie Ihre Daten sind gegen. Der GLM, die bestimmt, basierend auf unseren eigenen Daten war kann in 4C zu sehen. Es besteht auch die Möglichkeit des Hinzufügens zusätzlicher verwechseln EV wie Bewegungsparameter,tieffrequente Geräusche (Scanner Drift) oder auch physiologische Parameter wie Blutdruck, allgemeine physiologische Arzneimittel-Wirkungen zu entfernen.
    Innerhalb FEAT: Verwenden FILM prewhitening. In zeitlichen Ableitung. In der Kontraste & F-Tests Registerkarte Einrichtung eines Kontrasts. Um eine einzelne EV in ein Z-Statistik Bild konvertieren, stellen Sie den Kontrast Wert auf 1. Dies gibt Ihnen alle Voxel, in denen ihr zeitlicher Verlauf erheblich von der GLM erklärt werden können. Wird der Wert auf -1 geben die negative Aktivierung.
  4. Nach Durchführung der ersten statistischen Test muss das resultierende Bild auf einem Schwellenwert Statistik zu zeigen, welche Voxel oder Cluster von Voxeln zu einem bestimmten Signifikanzniveau aktiviert werden. Mehrere Vergleiche Korrektur aufgrund der großen Anzahl von Gehirnzellen Voxel getestet benötigt. Das FSL-Programm FEAT nutzt eine automatisierte Cluster-basierte multiple Vergleiche Korrektur auf die GRF (Gaussian Random Field) 25 Theorie basiert.
  5. Schließlich sollten die Daten räumlich sein normiert auf einem Referenzbild, um Gruppenstatistiken durchzuführen. Registrieren Sie zuerst die Funktionsdaten für die Tiere Gehirn extrahiert anatomische Bild und dem Referenzbild. Wir nutzten die stereotaktische Rattenhirn Vorlage von Schwarz 14 als Referenz Gehirn beschrieben.
  6. Danach kann die First-Level-Analysen von allen Tieren in höheren Ebene (Gruppe) statistische Analysen kombiniert werden. Dies ist stark abhängig von Ihrer eigenen Studiendesign und Forschungsfragen.

6,3

Danach kann die First-Level-Analysen von allen Tieren in höheren Ebene (Gruppe) statistische Analysen kombiniert werden. Dies ist stark abhängig von Ihrer eigenen Studiendesign und Forschungsfragen.

6,4

Physiologische chemotherapeutische Effekte koppelbar oder korreliert ist mit dem MR-Signal, falls gewünscht. Siehe auch Abschnitt 6.2.3 über das Hinzufügen verwechseln EV.

7. Repräsentative Ergebnisse

ove_content "> Wenn die herausfordernde Medikament (5 mg / kg iv Fluoxetin) das Gefäßsystem eintritt, sollte eine klare physiologische Reaktion sein, Atemfrequenz (nach oben) und Blutdruck (unten) sichtbar. Diese Reaktionen normalisieren im Durchschnitt innerhalb von 5-10 min . In Abbildung 3 sind diese Abfall des Blutdrucks ist deutlich sichtbar.

Die durchschnittliche Signal Zeitverlauf sollte zeigen eine relativ stabile Basislinie und eine klare Wirkung der Herausforderung. Vorzugsweise sollte es keine Challenge-unabhängigen Drift des Signals. Ein repräsentatives Beispiel eines durchschnittlichen Signal-Zeit-Verlauf kann in 5A zu sehen ist. Artefakte, wie Atmung Depression / Ausfall oder Veränderungen in der Anästhesie sind oft deutlich sichtbar im Signal. Atemdepression wird sich negativ auf das Signal im gesamten Gehirn. Dies kann in 5B zu sehen.

Nach dem ersten Level-Analyse wird das Aktivierungsmuster erwartet, dass sie überwiegend positiv und locaTed nur in bestimmten Regionen (z. B. kortikale Areale, Hippocampus, Hypothalamus und Thalamus; siehe 6A). Wenn das gesamte Gehirn ist ausgeschaltet, ist dies oft ein Hinweis auf zu tiefe Narkose und / oder Sauerstoffmangel während des Scannens. Ein Beispiel dafür kann in 6B zu sehen.

1
Abbildung 1. Lage der Platzierung der Kanülen in der Arteria und Vena femoralis.

2
Abbildung 2 Schematische Darstellung der MRT-Setup;. Die gesamte Ausrüstung muss nicht ferromagnetischen und ist mit einem Modul-System, die gated Erfassung von Bildern Vermeidung von Interferenzen durch Bewegung durch Atmung und / oder Herz schlagen lässt verbunden. Die Körpertemperatur wird auch durch ein Heizmodul reguliert zu überwachen und zu steuern das Tier Temperatur während der Bilderzeugung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Abbildung 3
3. Repräsentatives Beispiel von Blutdruckdaten. Es gibt einen klaren Abfall des Blutdrucks sichtbar direkt nach dem Beginn der Infusion (roter Balken). Normale Werte sind wieder innerhalb von 10 min erreicht. nach der Herausforderung Verwaltung.

Abbildung 4
Abbildung 4. A) die erwartete Aktivierungsmuster mit der MRT-Analyse-Programm zu stimulieren (rot ist positiv, Aktivierung, blau ist negativ Aktivierung). B) Durchschnittliche zeitliche Verlauf aller aktivierten Voxel (≥ 1% Veränderung zum Ausgangswert) bei allen Tieren. C) Beispiel der resultierenden GLM-Modell in FSL / FEAT. Click hier, um größere Abbildung zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5.

  1. Beispiel für die positive Aktivierung. Der zeitliche Verlauf in den aktivierten Voxel (rot) wird nach etwa der Form des GLM-Modell. Infusion des Medikaments begann um Punkt 8 der Zeit.
  2. Beispiel für negative Aktivierung im gesamten Gehirn nach Narkose zu tief. Der zeitliche Verlauf in den negativ aktiviert Voxel (blau) zeigen einen allgemeinen Rückgang der Signal und kein Effekt der Herausforderung sichtbar ist.

Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

6
Abbildung 6.

  1. Erwartete Aktivierungsmuster nach dem ersten Level-Analyse. Aktivierung von Clustern von Voxeln (rot yellow), nur in bestimmten Hirnarealen.
  2. Beispiel für "schlechte" Aktivierungsmuster. Whole-Brain-negativen Aktivierung (blau) in der gleichen Tier wie in 5B.

Discussion

5-HT phMRI ist ein viel versprechendes Instrument, um Neurotransmitter-Funktion bei Tieren in vivo zu beurteilen. Es visualisiert das Gehirn als Reaktion auf eine 5-HT-Herausforderung mit funktionellen MR-Bildgebung. MRT hat den großen Vorteil, eine hohe räumliche Auflösung zu haben und nicht brauchen die Injektion von Kontrastmittel-Agenten oder radioaktiv markierten Molekülen wodurch die wiederholte Exposition durch ionisierende Strahlungen. Diese Technik ist in menschlichen und tierischen Probanden und daher sehr gut geeignet für translationale Forschung von Neurotransmitter-Systemen und psychiatrischen Erkrankungen. Seine Anwendung ist natürlich nicht auf den 5-HT-Weg begrenzt und wurde bereits ausführlich auf die Auswirkungen von dopaminergen Medikamenten bei Tieren und Menschen 5,15 22 Beurteilung verwendet.

Dennoch phMRI bei Kleintieren herausfordernden bleibt, wie bereits in Übersichtsartikeln von Martin und Sibson 11 und 20 wies Steward. Eine dieser Herausforderungen ist die Wartung of stabilen physiologischen Parameter während der Bildaufnahme. Die meisten Anästhetika verändern können Herz-Kreislauf-Funktion und da phMRI entscheidend davon abhängen, Herz-Kreislauf / hämodynamischen Parameter ist es wichtig, sicherzustellen, dass alle hämodynamischen Veränderungen ausschließlich auf die Droge gegeben sind Herausforderung ist. Es ist daher äußerst wichtig, dass pCO 2 Ebenen konstant bleiben während der Baseline-Akquisition. Mechanische Lüftung können, um sicherzustellen, physiologische Stabilität und wird oft in dieser Art von Experimenten verwendet. Wir jedoch entschieden, frei atmenden Tieren zu verwenden, um die Möglichkeit offen lassen, um Längsschnittstudien in der Zukunft durchzuführen. Stattdessen haben wir ausgiebig überwacht (und veränderte) Atemfrequenz und Blutgaswerte auf physiologische Stabilität im Normbereich zu gewährleisten, bevor der funktionalen Überprüfung zu starten und auf diese Weise stabile Gefäßreagibilität bewahren und damit T2 * / T2-Signal. Literatur über die Wirkung von Anästhetika auf die zerebrale Hämodynamik und metabolism ist reichlich 20 und würde den Rahmen dieses Manuskripts. Wir entschieden uns, Gas Anästhesie mit ± 2% Isofluran in diesem spezifischen Protokoll zu verwenden, da mit Inhalationsanästhetika, die Narkosetiefe schnell sein kann und leicht zu steuern. Dies ist in unserer Einrichtung wichtig, normalen Bereich stabil pCO 2 Ebenen vor Beginn der Bildaufnahme zu gewährleisten. Isofluran ist die am häufigsten verwendeten Inhalations-Anästhetikum heute und ermöglicht ein schnelles Ein-und Ausleitung, die wichtig für Langzeitstudien ist. Es produziert auch geringen kardiovaskulären und respiratorischen Depression und induziert eine gute Relaxation der Skelettmuskulatur.

Zweitens ist die intravenöse Verabreichung des Medikaments herausfordernden komplizierter bei Kleintieren als beim Menschen. Die Operation, die für die Kanülierung der Arteria und Vena femoralis benötigt wird, erfordert gut ausgebildete und erfahrene Mitarbeiter. Aufgrund dieser invasiven Verfahren ist es im Moment vor allem im Terminal verwendeten Verfahren. Allerdings könnten nicht-invasive Überwachung von Blut-Homöostase und Schwanzveneninjektion für Längsschnittstudien 23 verwendet werden.

Darüber hinaus gibt es einige allgemeine Einschränkungen für die Technik, die nicht spezifisch für tierische phMRI. Darüber hinaus wies darauf hin, wie von Martin und Sibson 11, ist ein potentieller verwechseln aller fMRT-Studien, dass davon ausgegangen wird, dass die Veränderungen in der Hirnaktivität von der Herausforderung evozierte Veränderungen der neuronalen Aktivität statt peripheren systemischen Wirkungen zu reflektieren. Vor allem in tieferen Hirnstrukturen, bleibt eine relativ schlechte Verständnis der neurovaskulären Kopplung (Beziehung zwischen neuronaler Aktivität und Veränderungen hämodynamischen Veränderungen). Studien von der Art, Logothetis 10 durchgeführt, um neurovaskuläre Kopplung in der Rinde zu bestimmen noch nicht in anderen Teilen des Gehirns durchgeführt. Es ist daher unbekannt, was eine Erhöhung der BOLD-Signal in wichtige Strukturen wie das Striatum oder Amygdala ist Telling uns über neuronale Aktivität. Das Beste, was wir in diesem Moment sagen könnte ist, dass die Hirnregion, an die angegebene Herausforderung reagiert und dass in Abhängigkeit von der Behandlung und / oder Bedingungen, können wir die wesentlichen Veränderungen des Gehirns Reaktivität zu überwachen. Dies kann weitgehend Dazu suchen Sie in beiden MRT-Daten und physiologischen Reaktionen nachgewiesen werden. Das allgemeine Muster der Gehirnaktivität sollte abhängig vom und beschränkt sich auf Gebiete mit, in diesem Fall eine hohe 5-HT Innervation, und nicht so viel eine allgemeine vaskuläre Reaktion. Auch wird eine unterschiedliche zeitliche Verlauf zwischen vaskulären und hämodynamischen Veränderungen zu erwarten. Während die Veränderungen des Blutdrucks auf ihre Ausgangswerte zurück innerhalb von einigen Minuten ist die Wirkung des Medikaments auf den BOLD-Aktivierung im Fall von Fluoxetin sichtbar, bis zum Ende der Bildaufnahme und entsprechen den pharmakokinetischen Eigenschaften wissen von dieser Droge. Schließlich sollten die physiologischen Reaktionen von allen Tieren sein, um interindividuelle Vergleiche anzustellen ähnlich. Nonetheless ist es bekannt, dass eine neurogene Regelung der lokalen Blutflusses nach 5-HT 4-abgegeben. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass lokale Änderungen des BOLD-Signal kann zu Gefäßveränderungen aufgrund der 5-HT in der Nähe von Schiffen Release Attribute werden. Obwohl diese Effekte nicht lokale neuronale Aktivierung verbunden sind und somit als falsch-positiven Ergebnissen in Betracht gezogen werden, ist es auch ein Index für die gesamte spezifische Funktion des 5-HT-System (siehe auch 3).

Kritische Schritte dieser Technik sind daher zu physiologischen Reaktionen intensiv zu überwachen und sicherstellen, dass die physiologischen Bedingungen des Tieres stabil sind vor und während der Bildaufnahme. Auch Scanner Bedingungen sollten so stabil wie möglich und genau das gleiche für jedes Tier. Signal-Stabilität Ihrer Sequenz sollte geprüft und bestätigt werden vor Beginn des Experiments. Weiterhin ist zu beachten, immer groß genug statistische Power, auch bei kleinen Gegenstand Groups. Für einen schönen Beitrag über den experimentellen Überlegungen tierischen phMRI im Allgemeinen finden Sie Steward 20 und für ein zusätzliches Beispiel für ein experimentelles Protokoll für pharmakologische fMRT bei Ratten und Mäusen, siehe Ferrari 5.

Mögliche Änderungen der hier beschriebenen Technik sind zahlreich. Man könnte:

  1. mit einem anderen Medikament für 5-HT Herausforderung, wie zum Beispiel einem anderen SSRI oder 5-HT-Rezeptor-(ANT)-Agonisten 16,13,18,7 oder sogar eine doppelte Herausforderung, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Arzneimittelwirkung 6,19 offenbaren;
  2. verwenden Sie eine andere Versuchsanordnung, wie zum Beispiel einem anderen Regime Anästhesie, Beatmung, Blut-Pool Kontrastmittel statt BOLD 15, Längsschnittstudien (Tier muss am Leben gehalten werden, so dass keine invasiven Blutdruck-/ Blut-Gas-Messung und / oder mechanische Lüftung sind möglich), oder auch Kombinationen mit anderen (invasive) Verfahren wie die Aufnahme der neuronalen Aktivität mittels MR-kompatiblen Elementenctrodes 10 oder PET / SPECT-Untersuchungen 4;
  3. verwenden verschiedene MRT-Daten Analysemethoden wie der "p-Block"-Methode von McKie 12 oder funktionelle Konnektivität Analyse 15.

Welche Auswahl, die Sie in den experimentellen Aufbau ist stark abhängig von den Möglichkeiten der und / oder der Erfahrung innerhalb Ihres Labors und der Art der Fragestellung Sie beantworten möchte.

Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) (Veni-Nr. 916.86.125), verliehen an L. Reneman finanziert. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf Studiendesign, Datenerhebung und-analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Erstellung des Manuskripts. Es gibt keine Interessenkonflikte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott Laboratories No B506 Mix with medical air
Medical air BOC Healthcare
Heating pad Harvard Apparatus 507223F Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe, Medium, 230 VAC, 50 Hz
Silk ligature Harvard Apparatus 2-0 black braided silk non-absorbable Cat Num 51-7631
PE-50 Cannula Scientific Laboratory Supplies LTD Portex Tubing PE 0.58x0.96mm 0.58 ID 0.96 OD mm
Heparin sodium Leo Laboratories Heparin sodium 1000IU/ml 15 U/ml
Vetbond Tissue Adhesive 3M MVetbond Tissue Adhesive
Monitoring system SA Instruments http://www.i4sa.com Model 1025L monitoring system Monitors respiration and temperature
Pressure transducer Biopac Systems, Inc. BLOOD PRESSURE TRANSDUCER - TSD104A MP150 DATA ACQUISITION SYSTEM - WIN - MP150WSW Monitors blood pressure
RapidLab blood gas analyzer Siemens AG RAPIDLab 248/348 Systems
4.7T animal scanner Agilent Technologies 4.7T frequency 199.845 MHz
MR compatible stereotactic bed m2m Imaging Corp Rat bed: PA Multi element AHS 50-72-1003/100
Coil m2m Imaging Corp Volume TH/Rx RQD1 72/112 200
Fluoxetine Hydrochloride Sigma-Aldrich F-132 5mg/kg in saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  2. Anderson, I. M., McKie, S., Elliott, R., Williams, S. R., Deakin, J. F. Assessing human 5-HT function in vivo with pharmacoMRI. Neuropharmacology. 55, 1029-1037 (2008).
  3. Choi, J. K., Chen, Y. I., Hamel, E., Jenkins, B. G. Brain hemodynamic changes mediated by dopamine receptors: Role of the cerebral microvasculature in dopamine-mediated neurovascular coupling. Neuroimage. 30, 700-712 (2006).
  4. Cohen, Z., Bonvento, G., Lacombe, P., Hamel, E. Serotonin in the regulation of brain microcirculation. Prog. Neurobiol. 50, 335-362 (1996).
  5. Ferrari, L. A robust experimental protocol for pharmacological fMRI in rats and mice. J. Neurosci. Methods. 204, 9-18 (2011).
  6. Gozzi, A. Differential effects of antipsychotic and glutamatergic agents on the phMRI response to phencyclidine. Neuropsychopharmacology. 33, 1690-1703 (2008).
  7. Houston, G. C. Mapping of brain activation in response to pharmacological agents using fMRI in the rat. Magn Reson. Imaging. 19, 905-919 (2001).
  8. Jenkins, B. G., Sanchez-Pernaute, R., Brownell, A. L., Chen, Y. C., Isacson, O. Mapping dopamine function in primates using pharmacologic magnetic resonance imaging. J. Neurosci. 24, 9553-9560 (2004).
  9. Klomp, A. Lasting effects of chronic fluoxetine treatment on the late developing rat brain: age-dependent changes in the serotonergic neurotransmitter system assessed by pharmacological MRI. Neuroimage. 59, 218-226 (2012).
  10. Logothetis, N. K., Pauls, J., Augath, M., Trinath, T., Oeltermann, A. Neurophysiological investigation of the basis of the fMRI signal. Nature. 412, 150-157 (2001).
  11. Martin, C., Sibson, N. R. Pharmacological MRI in animal models: A useful tool for 5-HT research. Neuropharmacology. 55, 1038-1047 (2008).
  12. McKie, S. Neuronal effects of acute citalopram detected by pharmacoMRI. Psychopharmacology (Berl. 180, 680-686 (2005).
  13. Preece, M. A. Evidence that increased 5-HT release evokes region-specific effects on blood-oxygenation level-dependent functional magnetic resonance imaging responses in the rat brain. Neuroscience. 159, 751-759 (2009).
  14. Schwarz, A. J. A stereotaxic MRI template set for the rat brain with tissue class distribution maps and co-registered anatomical atlas: application to pharmacological MRI. Neuroimage. 32, 538-550 (2006).
  15. Schwarz, A. J., Gozzi, A., Reese, T., Bifone, A. In vivo mapping of functional connectivity in neurotransmitter systems using pharmacological MRI. NeuroImage. 34, 1627-1636 (2007).
  16. Sekar, S. Neuroadaptive responses to citalopram in rats using pharmacological magnetic resonance imaging. Psychopharmacology (Berl). 213, 521-531 (2011).
  17. Smith, S. M. Advances in functional and structural MR image analysis and implementation as FSL. NeuroImage. 23, Suppl 1. S208-S219 (2004).
  18. Stark, J. A., McKie, S., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. 5-HT(2C) antagonism blocks blood oxygen level-dependent pharmacological-challenge magnetic resonance imaging signal in rat brain areas related to feeding. Eur. J. Neurosci. 27, 457-465 (2008).
  19. Stark, J. A., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. Functional magnetic resonance imaging and c-Fos mapping in rats following an anorectic dose of m-chlorophenylpiperazine. NeuroImage. 31, 1228-1237 (2006).
  20. Steward, C. A., Marsden, C. A., Prior, M. J., Morris, P. G., Shah, Y. B. Methodological considerations in rat brain BOLD contrast pharmacological MRI. Psychopharmacology (Berl). 180, 687-704 (2005).
  21. Strupp, J. P. Stimulate: A GUI based fMRI Analysis Software Package. NeuroImage. 3, S607 (1996).
  22. Tomasi, D. Methylphenidate enhances brain activation and deactivation responses to visual attention and working memory tasks in healthy controls. Neuroimage. 54, 3101-3110 (2011).
  23. Woolrich, M. W. Bayesian analysis of neuroimaging data in FSL. NeuroImage. 45, S173-S186 (2009).
  24. Worsley, K. J. Statistical analysis of activation images. Functional MRI: An Introduction to Methods. Jezzard, P., Matthews, P. M., Smith, S. M. OUP. (2001).
Die Verwendung von pharmakologischen fMRT-Herausforderung in der präklinischen Forschung: Anwendung auf die 5-HT-System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).More

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter