Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Pre-klinik araştırma Farmakolojik-meydan fMRI Kullanımı: 5-HT Sistemi Uygulaması

doi: 10.3791/3956 Published: April 25, 2012

Summary

Bu tekniğin amacı farmakolojik manyetik rezonans görüntüleme (phMRI) ve selektif serotonin geri alım inhibitörü (SSRI), fluoksetin ile birlikte iv meydan okuma ile canlı ve ücretsiz-nefes hayvan serotonin (5-HT) nörotransmitter fonksiyonu değerlendirmektir.

Abstract

Farmakolojik MR (phMRI) sonuçta depresyon ve DEHB gibi uyuşturucu eylem ve nörotransmitter ilişkili bozukluklar arkasında yatan nörobiyolojik mekanizmaları açıklığa kavuşturabilmek için kullanılabilir beyin fonksiyonu üzerinde maddelerin etkilerini incelemek amacıyla yeni ve umut verici bir yöntemdir. Görüntüleme yöntemleri (PET, SPECT, CT) çoğu gibi beyin hastalıklarının araştırılması ve genel nöronal bağlantı saygı ile non-invaziv bir şekilde nörotransmiter yolların ilgili fonksiyon bir ilerlemeyi temsil ediyor. Üstelik o da klinik araştırmalar için çeviri için ideal bir araçtır. MRG, hala arkasında moleküler görüntüleme stratejileri PET ve SPECT ile karşılaştırıldığında ise büyük avantaj böylece iyonize radyasyona maruz kalma tekrarlayan kaçınarak, yüksek uzaysal çözünürlük ve kontrast madde ya da radyo-işaretli moleküllerin enjeksiyon için gerek sahip olması gerekir . Bu g nerede Fonksiyonel MRI (fMRI) yaygın, araştırma ve klinik ortamda kullanılırenerally bir psiko-motor görev ile birlikte. phMRI belirli bir zorlu ilaç verildikten üzerinden etkinleştirme sonrasında fizyolojik veya patolojik koşullar altında serotonin gibi belirli bir nörotransmitter sistemi, (5-HT), soruşturma sağlayan fMRI bir uyarlamasıdır.

Burada anlatılan yöntem amacı serbest solunum hayvanlarda beyin 5-HT fonksiyonunu değerlendirmek etmektir. Aynı anda zaman içinde fonksiyonel MR görüntüleri elde edilirken, 5-HT sistemi meydan okuyarak, bu zorluğa beynin tepki görüntülenebilmekte. Hayvanları çok sayıda çalışmalar zaten örneğin 5-HT (salgılatıcı ilaçlar, seçici geri alım blokerleri, vb) ekstraselüler düzeyde uyuşturucu kaynaklı artışlar (BOLD) bağımlı MRG sinyalleri (bağlı sinyal kan oksijenlenme düzeyinde bölgeye özgü değişiklikler uyandırmak olduğunu göstermiştir oksijen ve g sağlamak için kan akımı artışı ile beyin aktivasyonu sırasında meydana deoxygenated / oksijenli hemoglobin düzeyi değişikliğinörotransmiter fonksiyon indeksi sağlayan) talep nöronlara lucose. Ayrıca, bu etkilerin tedaviler bu azalma 5-HT durumu 16,13,18,7 ile tersine çevrilebilir olduğu gösterilmiştir. Yetişkin sıçanlarda, akut SSRI uygulamadan sonra BOLD sinyal değişikliklerinin birkaç 5-HT ilişkili beyin bölgelerinin, yani kortikal alanlar, hipokampus, hipotalamus ve talamus 9,16,15 tarif edilmiştir. 5-HT sisteminin uyarılması ve bu sorun olan tepkisi, böylece hayvanlarda ve insanlarda 2,11 her iki fonksiyonu bir ölçü olarak kullanılabilir.

Protocol

In vivo MR görüntüleme için hayvan hazırlanması

1. Cerrahi kanülasyonu

  1. Medikal hava verilen izofluran (hayvan hazırlanması ve tarama sırasında anestezi idamesi için% 1.5-2 düşürüldü sonra% 5 indüksiyon ve) (% 21 O 2, BOC UK) ile birlikte sıçan (Wistar sıçan, 200-300 gr), uyuştur . Hayvan iyi anestezi ve bir ayak tutam hiçbir yanıt sergiler emin olun. Femoral arter ve ven kan gazı ve kan basıncı ölçümleri ve sırasıyla ilaç meydan yönetimi için deliklidir. Cerrahi işlem sırasında hayvanın vücut sıcaklığı izlenir ve bir rektal prob ve termal battaniye (Harvard aparat) ile korunur.
  2. Anestezi hayvan dorsal bir mikroskop altında bir ısınma pad üzerinde konumlandırılmış. Orta-uyluk bölgesi ve alkol ile sürüntü cilt Tıraş. Karın ve sağ uyluk oluşan kırışıklık boyunca 2 cm cilt kesisi olun.Adduktor kas künt diseksiyon femoral arter, ven ve femoral sinir görselleştirmek için kullanılır. Dikkatli gemiler ayırın.
  3. Yavaşça damarın distaline sonunda tam bir ipek kravat ve bağ proksimal sitede gevşek bir cerrahi düğüm yarısı ile başka bir kravat yerleştirin. Bitişik harfler arasındaki maruz kalan geminin kalan orta kısmı kan akımının tıkanması için, hem ligatür için çekiş uygulayın. Sağlamak için geminin bu bölümünde geminin çevresi yaklaşık üçte birinde küçük bir kesi yapmak bir PE-50 kanül (aksi erişkin erkek sıçanlarda durumunda dış çapı 0.54 mm iç çapı ve 0.96mm, 0.40 mm ID ve ekleme kabına 0,80 mm ED).
  4. Kanül damar içine birkaç mm (en azından 5) yerleştirilmelidir. Bir kez lümenine, kan pıhtılaşması oluşumunu herhangi önlemek için damar yoluyla heparinize salin küçük bir miktarı (15 IU / ml) flush. Proksimal ipek döngü de kanül düzeltmek için tamamen bağlandı edilir. Rikinci gemi için bu yordamı EPEAT. Tutkal iki kanül yerinde olduğu bir Vetbond Doku Yapıştırıcısı (3M Birleşik Krallık plc, Bracknell, Birleşik Krallık) kullanarak cilt. Kanüller tam yerleştirme için Şekil 1'e bakınız.
  5. Yüzükoyun pozisyonda bir MR uyumlu stereotaktik yatak (m2m Görüntüleme Corp, ABD) hayvan yerleştirin. Kulak çubukları ve bir diş çubuğun ekleme yoluyla hayvanın kafası korur. Bu noktada, hayvan görüntüleme için MRI tarayıcı yerleştirilebilir. Hayvan anestezi kalır ve tüm görüntüleme işlem boyunca serbest nefes olduğunu.

2. İzleme

Tüm görüntüleme işlemi sırasında, çeşitli fizyolojik yanıtlar sürekli kontrol edilmeli ve mümkün olduğunca sabit tutulmalıdır. Bu yanıtları phMRI sinyali olarak aynı pencere içinde büyük ölçüde değişebilir ve ayrıca faiz sinyali etkileyebilir, çünkü bu çok önemlidir. Bu hayvan ma yer verilmekte olduğu da önemlidirGNET ve yeterli anestezi derinliği sağlamak için, anestezi derinliği standart kontroller (örneğin ayak tutam) mükellef görme nedenle dışarı değil. Buna ek olarak, bir çok örneğin ilaçların tansiyon gibi kardiyovasküler parametreleri değiştirebilir göz önüne alındığında, bu ölçümü hesap phMRI veri ilacın aksiyon küresel fizyolojik etkilerinden alınabilir sağlamak için kritiktir. Ayrıca başlangıç ​​değerleri ve 5 mg / kg fluoksetin infüzyonu beklenen yanıtları için 4. bölüme bakınız.

  1. Vücut ısısı 37 tutulur ± 1.5 ° C sıcak hava ısıtma sistemi (SA Instruments, New York, ABD) tarafından. MR sıcaklık ölçümü etkileyebilir unutmayın, kendi sistemi ile kontrol.
  2. Basınç sensörü (SA Instruments, New York, ABD) ile birleştiğinde bir solunum manşet kullanarak hayvanın solunum hızı izlemek ve kaydetmek.
  3. Bir basınç dönüştürücü (TSD104A, Biopac Systems Corp, ABD) kullanılarak invaziv kan basıncı kaydedin ve düzenli bir çekilmearteriyel pCO 2 ve oksijen kısmi basıncı (pO2) izlemek için görüntüleme sırasında kanüllü femoral arter yoluyla kan gazı örnekleri (Rapidlab, Siemens tanı) analiz ediyorum.
  4. Farmakolojik challenge (tuzlu su içinde çözülmüş fluoksetin (Sigma-Aldrich, Birleşik Krallık gelen fluoksetin hidroklorürün) çözeltisi, 5 mg / kg), ana infüzyon hattı olarak kanüle femoral damara kullanabilir.

In vivo görüntülemede

FMRI deney düzeneği şematik gösterimi Şekil 2'de verilmiştir.

3. Görüntüleme Parametreler

  1. Hayvan tarayıcının içine yerleştirilen ve istikrarlı fizyolojik tepkileri göstermeye devam edildikten sonra, görüntüleme başlayabilirsiniz. Bizim çalışmalarımızda, bir silindirik dördün iletim / 72 mm iç çapı (m2m Görüntüleme Corp, ABD) ile RF bobin alma ile 4.7 T küçük hayvan MR sistemi (Agilent teknolojileri) kullanılır. Doğru p için üç uçak izci görüntü olungörüş alanını MRI ortasında beyin osition ve beyinde manyetik alanın homojenliği iyileştirmek için lokalize dolgu düzeltimi (fastmap dizisi) kullanabilir.
  2. Her hayvan için, üretim tarihi ve segmentasyon amaçlı T2 ağırlıklı anatomik görüntü hacim kazanır. Biz eko tren uzunluğu = 8 bir turbo spin eko sekansı kullanılır; matris boyutu = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm 2; 1 mm kalınlığında 30 bitişik koronal kesitler serpiştirmeli satın, arka kenarına kaudal 8 mm merkezli koku ampul; ortalamaları = 4; TR / TE = 5112/60 ms.
  3. Fizyolojik tepkiler phMRI tarama yapmadan önce sabit olduğu hayvan emin olun. Zaman serisi edinimi için, eko tren uzunluğu = 16 ile aynı T2 ağırlıklı turbo spin eko sekansı kullanılır; matris boyutu = 128 x 128; TR / TE; aynı pozisyonda ortalanan 1 mm kalınlığında 20 bitişik dilim serpiştirmeli satın = 4915/60 ms. Toplam olarak, biz bir bir ile 32 kez puan eldezaman serisi hacim başına 158 sn ve 84 dak toplam tarama süresi cquisition zaman. Ilk cildi T1 doygunluk etkileri ele almak için bir 'kukla tarama' olarak kullanılan ve veri analizi kullanılmaz. Böyle gradiyent eko ya da eko planar görüntüleme (EPI) sekansları gibi diğer fMRI dizileri de kullanılabilir. Denemeniz başlamadan önce seçtiğiniz dizisi sinyal kararlılığını değerlendirmek için emin olun.
  4. Meydan ilaç uygulanmadan önce, taban cildi sayısını edinin. Biz istikrarlı koşullar altında taban alım en az 10 dakika öneririz. Tüm hayvanlar için tam olarak aynı zamanda infüzyon başlar. Bizim protokolde, biz 9. hacminin başlangıç ​​(yaklaşık 21 dk temel tarama sonra) idaresi başladı. Infüzyon sonra, görüntü alma başka bir 60 dakika (toplam 32 cilt) devam etti. Emin olun sonrası infüzyon dönemi değişiklikleri görmenizi ve kararlı durum ya da sinyal kurtarma ulaşmak için, kendi araştırma sorunlarınızda bağlı olarak yeterince uzunve ilaç testi seçiminiz.
  5. Görüntü alma işlemi tamamlandığında, tarayıcıdan hayvan çıkarın. Kan gazı parametreleri istikrarını sağlamak için ve temel fizyolojisi üzerinde ilacın etkilerinin değerlendirilmesine olanak verecek son bir kan gazı ölçümü yapın.

Veri işleme

4. Fizyolojik Tepkiler

Meydan beklenen fizyolojik yanıtlar seçilmiş bir ilaç bağlıdır. Aşağıda, genel olarak kabul edilen başlangıç ​​değerleri (yetişkin erkek sıçanlarda) ve 5 mg / kg fluoksetin iv infüzyon için beklenen yanıtları verilmiştir.

  1. Solunum hızı 45-75 soluk / dk stabil olmalıdır. Fluoksetin farmakolojik zorluk solunum hızı kısa bir artış (% 15-20) neden olur.
  2. Kan basıncı sürekli ve 100-150 mmHg (Biopac Systems Corp, Goweta, ABD) arasında olmalıdır. Fluoksetin zorluk arteriyel kan basıncı yaklaşık% 20 kısa ama dik bir düşüş neden olur.Bu 5-10 dakika içinde kurtarmak gerekir. Bu, Şekil 3 'de gösterilmiştir.
  3. Kan gazı değerleri stabil olarak (en az iki kez ölçülmesi) ve phMRI tarama başlamadan önce aşağıdaki aralıklarda olmalıdır: pCO 2, 35-45 mmHg; pO 2, 80-130 mmHg, pH, 7,35-7,45. Her zaman hayvan sabit kaldı olmadığını ve temel fizyolojisi üzerinde ilacın etkilerinin değerlendirilmesine olanak verecek taramadan sonra tekrar bu değerleri kontrol edin. Yüksek pCO 2 değerleri vazodilatasyona neden olur ve böylece BOLD sinyal değişiklikleri görmemek olacaktır.
  4. Hayvan anestezi sürekli ve sabit bir seviyede altında olduğundan emin olun (2 ±% 0,25; yüksek seviyelere serebrovasküler reaktivite depresyon ve düşük yetersiz anestezi ve böylece hareket etmesine neden olabilir) önemlisi phMRI tarama başlayan ve önce, herhangi bir ayarlamaları önlemek Bu gibi fonksiyonel görüntü alımı sırasında anestezi rejimi (örneğin% izofluran ve / veya gaz akışı) da BOLD sinyali etkileyebilir.

Burada İstatistiksel analizler için veri optimalize amacıyla MR veri ön işleme birkaç adımları açıklanmaktadır. Ancak biz birçok farklı araçları vardır, bizim laboratuarında kullanılan araçları söz.

5.1 Veri hazırlama

  1. Eğer (FSL programları için NIfTI1.1 veya Analyze7.5 biçimi) kullanmayı tercih MRG analiz yazılımı için doğru dosya biçiminde ham görüntüleri koyun. Birçok ücretsiz dosya dönüştürücü programları online mevcuttur. Kullanılan tarayıcı bağlı olarak, her şeyden önce ayrı 2D dilim bir 3D (anatomik tarama) veya 4D (phMRI scan) görüntü oluşturmak için gerekli olabilir. Bu tür ImageJ 1 olarak bir görüntü işleme programının kullanılarak yapılabilir.
  2. Insan verileri ile kullanımı (örneğin FSL programları) için tasarlanmış analiz algoritmaları ile uyumluluğu sağlamak amacıyla, voksel boyutu bir faktör 10 (bu da ImageJ örneğin kullanılarak yapılabilir) ile çarpılması gerekir. Bu çalışmada, bu 3,91 x 3,91 x 10 mm 3 arasında bir voksel boyutu ile sonuçlanmıştır.
  3. Görme yönde düzensizlikler, eserler, ve hareket için görüntüleri kontrol edin. Onlar size sonuçları bozar gibi analizler net eserler veya aşırı hareket ile taramaları kullanmamaya dikkat edin.
  4. Tüm tarama Oryantasyon anatomik ve fonksiyonel görüntüler arasında ve kullanılan referans beyin ile uyum içinde benzer olmalıdır. Bizim çalışmamızda, Schwarz 14 tarafından açıklanan stereotaktik sıçan beyin şablonu kullanılır. FSL komutu fslswapdim yeniden ayarlanması için de kullanılabilir.

5.2 Hareket düzeltme

  1. 4D zaman serisi herhangi bir hareket eserlerin düzeltmek için, hareket düzeltme aracı McFlirt (FMRIB Kullanıcı Lineer Görüntü Kayıt Aracı kullanırken Hareket Düzeltme, FMRIB en Yazılım Kütüphanesi parçası, kullanılan www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT intra-modal hareket düzeltme aracı desfMRI zaman serisi kullanım için igned ve optimizasyon ve flört kullanılan kayıt teknikleri, lineer (afin) inter-modal beyin görüntü kaydı için tam otomatik bir araç dayalı. Sonuç tatmin edici olup olmadığını her zaman sonradan kontrol edin.

5.3 Beyin segmentasyon

  1. 3D anatomik görüntü olarak 4D zaman serisi hem de bütün kafa bir görüntü dışındaki tüm beyin dokusu silin. Bunun için FSL aracı BET (Beyin Çıkarma Aracı v 2.1, FMRIB en Yazılım Kütüphanesi parçası, kullanılan www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). Varsayılan ayarları insan beyni ile kullanım için geliştirilen ve sıçan beyin için ideal böylece değildir. Ve kafa yarıçapı (mm), çoğu hayvanlar için r = 175;; fraksiyonel yoğunluğu eşik, g = 0.1, dikey degrade kesirli yoğunluğu eşik, f = 1.0: Biz şu parametreler kullanılır. Gerekirse, konu başına bu değerleri optimize edebilirsiniz.

6. Veri Analysis

MR verilerin istatistiksel analizi Amaç istatistiksel olarak sağlam bir şekilde uyuşturucu meydan atfedilebilecek ek varyans gösterirler voksellerden belirlemektir. Çeşitli metodolojik yaklaşımlar bile sayılabilir yazılım paketleri olarak, bu mevcuttur. Yaptığınız seçim laboratuar, yazılım ve bilgi / deneyim kullanılabilirliği ve özel araştırma sorusu bağlıdır. Burada bizim laboratuarımızda kullanıldığı gibi önerilen bir yöntem verdik.

6.1

  1. MRG verileri analiz etmeden önce, veri donatılmış olacak bir genel lineer model (GLM) belirler. Bu on-off modeli (off için ilaç öncesi ve sonrası ilaç infüzyonu için üzerine) basit bir kare veya veri dayanarak belirli bir model olabilir. Bu program bir veri tabanlı GLM modelini belirlemek için 21 teşvik kullandılar.
  2. Tüm post-challenge hacimleri vs bütün temel birimlerde iki örnek t-testi (Canlandıracak örneğin) yapın. İsteğe bağlı olarak, o terkut ilk ses (ler) ve bu kararlı durum görüntüleme temsil edemez beri meydan verildiği sırasında ses. Daha sonra, başlangıçtan itibaren belli bir% değişim daha tüm vokseller ayrımcılık. Biz% 1'den fazla değişiklik ile tüm vokseller kullanılır.
  3. Zaten modelin şekli bir izlenim veriyor, tüm bu voksellerden Next, ortalama süre ders. Meydan 1) etkisi etkisi zaman boyunca tekrar reddederse ya da bir yayla ve / veya tepe ve, 3) ulaştığında halinde derhal veya gecikmeli etkisi, 2) sahiptir ve bu şekilde de belirlenebilir tarayın. Örnekler Şekil 4A ve 4B 'de gösterilmiştir.

6.2

Bir sonraki adım istatistiksel önceki kurulan GLM modeli karşı her hayvanın ham 4D zaman serisi görüntü test sonra olduğunu. Bunun için FSL programı FEAT (FMRI Uzman Analiz Aracı, v5.98) 17,24 kullanılır. Ancak, diğer fMRI analiz araçları availa vardırde ble. Analiz aracı içinde, ilk seviye analizi kurmak gerekir. Bu, aşağıdaki adımları gerektirir:

  1. Her hayvan için aynı ayarları kullandığınızdan emin olun. Kararlı-hal görüntüleme o noktada henüz ulaşmış olabilir beri, analizden önce ilk (iki) birimleri silmek için seçebilirler. TR ayarlayın; Bu birbirini izleyen hacmi başlangıcı arasındaki süreyi (saniye olarak) 'dir. Eğer tüm tarama süresi sürebilirdi etkilerini arıyoruz beri, yüksek veya düşük geçiş filtresi ayarlamak için gerek yoktur.
  2. Uzaysal olarak gürültüyü azaltmak ve gürültü (SNR) oranı sinyali iyileştirmek için veri pürüzsüz. Biz 8 mm FWHM çekirdek seçti.
  3. Şimdi verilere istenilen GLM modeli çalıştırın. Bu temel açıklayıcı değişken (EV) 'dir, size veri karşı test ediyoruz dalga yani. Kendi verilerine dayalı olarak tespit edilmiştir GLM Şekil 4C görülebilir. Bu hareketin parametreleri gibi ek yenmek EV en eklenerek olasılığını da mevcutturDüşük frekanslı gürültü (tarayıcı sürüklenme) ya da genel fizyolojik uyuşturucu etkileri gidermek için kan basıncı gibi hatta fizyolojik parametreler.
    FEAT içinde: Kullanım FİLM prewhitening. Zamansal türev ekleyin. Kontrastlar & F-testleri sekmesinde, bir kontrast oluşturdu. Z istatistik görüntü tek bir EV dönüştürmek için, 1 olarak kontrast değerini ayarlayın. Bu size, zaman elbette önemli GLM açıklanabilir olduğu tüm vokseller verir. -1 Değerini ayarlama negatif aktivasyon verecektir.
  4. İlk istatistiksel test işleminden sonra, sonuçta elde edilen istatistik görüntü voksellerden ya voksellerden kümeleri özel bir önem düzeyinde aktif edildiği göstermek için eşiklenir gerekir. Çoklu karşılaştırmalar düzeltme test beyin voksellerden sayısının çokluğu nedeniyle gereklidir. FSL programı FEAT GRF (Gaussian Rastgele Field) teorisi 25 dayalı otomatik bir küme tabanlı çoklu karşılaştırmalar düzeltme kullanır.
  5. Son olarak, verilerin uzaysal olarak olmalıdır grubu istatistikleri gerçekleştirmek amacıyla, bir referans görüntü normalize. İlk hayvanların beyin çıkarılan anatomik görüntü ve daha sonra başvuru görüntüsüyle fonksiyonel verileri kayıt olun. Biz bir referans beyin gibi Schwarz 14 tarafından tarif stereotaktik sıçan beyin şablonu kullanılır.
  6. Bundan sonra, bütün hayvanların birinci düzey analizleri üst düzey (grup) istatistiksel analizler kombine edilebilir. Bu kendi çalışma tasarımı ve araştırma soruları oldukça bağımlıdır.

6.3

Bundan sonra, bütün hayvanların birinci düzey analizleri üst düzey (grup) istatistiksel analizler kombine edilebilir. Bu kendi çalışma tasarımı ve araştırma soruları oldukça bağımlıdır.

6.4

Fizyolojik ilaç yanıtları birleştiğinde veya istenirse, MR sinyali ile korele edilebilir. Utandırmak EV Kullanıcı ekleme hakkında da bölüm 6.2.3 bakınız.

7. Temsilcisi Sonuçlar

ove_content "> zorlu ilaç (5 mg / kg iv fluoksetin) vasküler sistem girdiğinde, açık bir fizyolojik tepki solunum hızı (yukarı) ve kan basıncı (aşağı) görünür olmalı. Bu yanıtlar, 5-10 dakika içinde ortalama normalize . Şekil 3'te kan basıncındaki bu düşme olduğu açıkça görülebilir.

Ortalama sinyal zaman tabii nispeten istikrarlı bir taban değeri ve net bir etki göstermelidir. Tercihen, sinyal hiçbir sorun-bağımsız sürüklenme olmalıdır. Ortalama bir sinyal zaman tabii temsili bir örnek, Şekil 5A görülebilir. Anestezi gibi solunum depresyonu / başarısızlık veya değişiklikler gibi eserler, sinyal genellikle net bir şekilde görülebiliyor. Solunum sistemi depresyonu olumsuz tamamını beyinde sinyal etkileyecektir. Bu, Şekil 5B görülebilir.

Ilk seviye analizlerden sonra, aktivasyon paterni çoğunlukla olumlu ve loca olması bekleniyorsadece belirli bölgelerde ted (yani kortikal alanlar, hipokampus, hipotalamus ve talamus; Şekil 6A bakınız). Tüm beyin devre dışı olursa, bu genellikle tarama sırasında çok derin anestezi ve / veya oksijen sıkıntısı bir göstergesidir. Bunun bir örneği, Şekil 6'da görülebilir.

Şekil 1
Şekil 1. Femoral arter ve ven kanüller yerleştirilmesi yeri.

Şekil 2
Şekil 2 MRG kurulum şematik gösterimi;. Tüm ekipmanı olmayan ferromanyetik olmalı ve izin nedeniyle nefes ve / veya kalp atışını, hareket gelen müdahalelerden kaçınmak görüntülerin kapılı kazanım bir modül sistemine bağlı. Vücut ısısı da görüntüleme sırasında hayvanın sıcaklığını izlemek ve denetlemek için bir ısıtma modülü üzerinden düzenlenir. Büyük resmi görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3
Şekil 3. Kan basıncı veri Temsilcisi örneği. Doğrudan infüzyon (kırmızı bar) başlamasından sonra görünür kan basıncında belirgin bir düşüş var. Normal değerler 10 dakika içinde tekrar ulaşılır. meydan okuma uygulaması sonrası.

Şekil 4
Şekil 4., Mavi) negatif aktivasyon MRG analiz programı (kırmızı pozitif aktivasyonu Canlandıracak kullanarak A) Beklenen aktivasyon modelidir. Bütün hayvanların tüm aktif voksellerden (başlangıçtan ≥ 1% değişim) B) Ortalama süresi kursu. C) FSL / FEAT ortaya çıkan GLM modelinin Örnek. Clbüyük rakam görmek için buraya ick.

Şekil 5,
Şekil 5.

  1. Pozitif aktivasyon örneği. Aktive voksellerden (kırmızı) zamanı, GLM modeli kabaca şekli takip ediyor. Ilaç infüzyonu zaman noktasında 8 civarında başladı.
  2. Çok derin anestezi sonrası tüm beyin negatif aktivasyon örneği. Olumsuz aktive voksellerden yılında zamanlı ders (mavi) genel bir sinyal bozulması ve meydan hiçbir etki görülebilir göstermektedir.

Büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 6
6 Şekil.

  1. Ilk seviye analiz yapıldıktan sonra aktivasyon paterni bekleniyor. Voksellerden kümelerinin Etkinleştirme (y için kırmızıellow), sadece belirli beyin bölgelerindeki.
  2. 'Kötü' aktivasyon deseni örneği. Şekil 5B, aynı hayvanda tamamen beyin negatif aktivasyonu (mavi).

Discussion

5-HT phMRI in vivo hayvan nörotransmiter fonksiyonu değerlendirmek için gelecek vaat eden bir araçtır. Bu fonksiyonel MR görüntüleme ile bir 5-HT meydan beyin yanıtı görüntüler. MRG yüksek uzaysal çözünürlük ve kontrast ajan veya dolayısıyla iyonize radyasyona maruz kalma tekrarlayan kaçınarak radyo-işaretli moleküllerin enjeksiyon gerekmez için büyük bir avantaja sahip. Bu teknik, insan, hayvan ve konularda uygulanabilir ve bu nedenle nörotransmitter sistemleri ve psikiyatrik bozuklukların translasyonel araştırma için çok uygundur. Bu uygulama 5-HT yolu ile sınırlıdır ve hali hazırda hem hayvanlarda ve insanlarda 5,15 22 dopaminerjik ilaçların etkilerini değerlendirmek üzere yaygın şekilde kullanılmaktadır değildir tabii ki.

Bununla birlikte, küçük hayvanlarda phMRI zorlu kalır, zaten Martin ve Sibson 11 ve 20 Steward tarafından inceleme yazılarında işaret etti. Bu zorluklardan biri bakım o olduğunugörüntü alımı sırasında f kararlı fizyolojik parametreler. En anestezikler kardiyovasküler fonksiyonu değiştirebilir ve phMRI herhangi bir hemodinamik değişiklikler verilen ilacın meydan sadece atfedilebilecek olmasını sağlamak için gereklidir kardiyovasküler / hemodinamiye eleştirel bağımlı olduğunu verilmesi gibi. Bu pCO 2 seviyeleri başlangıçta edinimi sırasında sabit kalır bu nedenle hayati önem taşımaktadır. Mekanik havalandırma fizyolojik stabilitesini sağlamak için, ve genellikle bu tür deneyler kullanılır. Biz ancak gelecekte uzunlamasına çalışmalar yapmak olasılığını açık bırakmak için Ücretsiz-nefes hayvanları kullanmayı seçti. Bunun yerine, geniş fonksiyonel tarama başlatmak ve bu yolla istikrarlı vasküler reaktivite korumak ve böylece T2 * / T2 sinyal önce normal sınırlarda fizyolojik istikrarı sağlamak için (ve değişen) solunum hızı ve kan gazı değerleri izlenir. Serebral hemodinami ve metabolis genel anesteziklerin etkileri hakkında Edebiyatım 20 bol ve bu yazının kapsamı dışındadır. Inhalasyon anestezi ile, anestezi derinliğinin hızla olabilir ve kolaylıkla kontrol edebilir, çünkü bu özel protokolde izofluran ±% 2 ile gaz anestezi kullanmayı seçti. Bu görüntü alımı başlamadan önce normal stabil pCO 2 seviyelerini sağlamak için elimizden kurulum önemlidir. Izofluran bugün en sık kullanılan uçucu anestezik ve uzunlamasına çalışmalar için önemli olan hızlı indüksiyon ve derlenme, sağlar. Ayrıca minimal kardiyovasküler ve solunum depresyonu üretir ve iskelet kaslarının iyi bir rahatlama neden olur.

İkincisi, zorlu ilacın intravenöz insanlarda daha küçük hayvanlarda daha karmaşıktır. Femoral arter ve ven kanülasyonu için gerekli cerrahi iyi eğitimli ve deneyimli bir kadro gerektirir. Bu invaziv girişimlerden dolayı esas olarak terminal işlemlerde kullanılan şu anda halen. Bununla birlikte, kan homeostazı ve kuyruk damarından enjeksiyon non-invasiv izleme uzunlamasına çalışmalar 23 için kullanılabilir.

Buna ek olarak, hayvan phMRI için spesifik değildir tekniği, bazı daha genel bir sınırlama yoktur. Buna ek olarak Martin ve Sibson 11 de belirttiği gibi, tüm fMRI çalışmaları potansiyel bir şaşırtmak o meydan tarafından uyarılmış beyin aktivitesinde değişiklikler oldukça periferik sistemik etkileri daha nöronal aktivitedeki değişiklikleri yansıtacak farz olmasıdır. Özellikle derin beyin yapıları, nörovasküler kaplin nispeten zayıf bir anlayış (nöronal aktivite değişiklikleri ve hemodinamik değişiklikleri arasındaki ilişki) kalır. Korteksinde nörovasküler kuplaj belirlemek için Logothetis 10 tarafından gerçekleştirilen tür çalışmaların henüz beynin diğer parçaları da yapılmamıştır. Önemli yapılarda BOLD sinyal artışı gibi striatum veya amigdala söylüyorum ne olduğunu bu nedenle bilinmiyornöronal aktiviteleri hakkında g bize. Biz şu anda söyleyebiliriz iyi beyin bölgesi verilen meydan tepki ve tedavi ve / veya koşullara bağlı olarak, beynin reaktivite önemli değişiklikler olup olmadığını izlemek olmasıdır. Bu büyük ölçüde MRG veri ve fizyolojik yanıtlar hem bakarak kontrol edilebilir. Beyin aktivasyonu genel desen Bu durumda, yüksek bir 5-HT innervasyon değil, kadar genel bir vasküler yanıt olarak, bölgelerde bölgeye özgü ve sınırlı olmalıdır. Ayrıca, vasküler ve hemodinamik değişiklikler arasında farklı bir zamansal profili bekleniyor. Kan basıncı değişiklikleri, birkaç dakika içinde bazal değere geri ise, BOLD aktivasyonuna ilacın etkisi görüntü toplama sonuna kadar görünür fluoksetinin durumda olduğunu ve bu ilacın bilmek farmakokinetik özellikler karşılık gelir. Son olarak, tüm hayvanların fizyolojik yanıtlar denekler arası karşılaştırmalar yapmak için benzer olmalıdır. Nonetheless, bunun 5-HT ile lokal kan akışının bir nörojenik düzenlemesi 4 mevcut olduğu bilinmektedir. Bu nedenle BOLD sinyal yerel değişiklikleri damarların yakınlığı 5-HT salınmasına bağlı vasküler değişikliklere bağlıyorlar olabileceği göz ardı edilemez. Bu etkilerin yerel nöronal aktivasyonu ile bağlantılı değildir ve bu nedenle yanlış olumlu sonuç olarak kabul edilebilir olmasına rağmen, aynı zamanda 5-HT sisteminin genel olarak belirli bir fonksiyon (3, aynı zamanda bakınız) bir göstergesidir.

Bu tekniğin Kritik adımları yoğun fizyolojik yanıtları izlemek ve hayvanın fizyolojik koşullar görüntü toplama öncesi ve sırasında stabil olduğundan emin olmak için bu nedenle. Ayrıca, tarayıcı koşulları mümkün olduğu kadar sabit ve her bir hayvan için tam olarak aynı olmalıdır. Sizin dizisi Sinyal istikrar kontrol ve deney başlamadan önce teyit edilmelidir. Ayrıca, hatta küçük konu Grou ile, her zaman yeterince büyük bir istatistiksel güç var emin olunps. Genel olarak hayvan phMRI deneysel düşünceler güzel bir inceleme için, Steward 20 görmek ve sıçanlar ve fareler farmakolojik fMRI için bir deney protokolünde bir başka örnek için, Ferrari 5'e bakın.

Burada açıklanan teknik Olası değişiklikler çoktur. Biri olabilir:

  1. Başka bir SSRI veya 5-HT reseptör (karınca) agonistleri 16,13,18,7 hatta bir çift meydan ilaç etkisinin 6,19 yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için olduğu gibi 5-HT meydan için farklı bir ilaç kullanıyorsanız;
  2. Böyle farklı bir anestezi rejimi, mekanik ventilasyon, kan havuzu kontrast maddeler yerine BOLD 15, boylamsal çalışmalar (hayvan canlı tutulması gerekir gibi farklı bir deney düzeneği, kullanın, böylece herhangi bir invazif kan basıncı / kan gazı ölçümü ve / veya mekanik ventilasyon ) mümkündür, veya MR-uyumlu elemanlar kullanarak bu tür nöronal aktivitenin kayıt gibi diğer (invaziv) yöntemleri ile bile kombinasyonlarıctrodes 10 veya PET / SPECT çalışmaları 4;
  3. Böyle McKie 12 veya fonksiyonel bağlantı analizi 15 'p-blok' yöntemi gibi farklı MR veri analizi yöntemleri kullanın.

Eğer deneysel kurulum yaptığınız seçimler olanakları ve / veya laboratuar ve cevaplamak istiyorum araştırma soru türü içinde deneyim son derece bağımlı olduğu.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma L. Reneman verilen Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (NWO) (Veni yok. 916.86.125) tarafından finanse edilmektedir. Destekçinizle hiçbir çalışma tasarımı rolü, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlığı vardı. Çıkar çatışması vardır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott Laboratories No B506 Mix with medical air
Medical air BOC Healthcare
Heating pad Harvard Apparatus 507223F Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe, Medium, 230 VAC, 50 Hz
Silk ligature Harvard Apparatus 2-0 black braided silk non-absorbable Cat Num 51-7631
PE-50 Cannula Scientific Laboratory Supplies LTD Portex Tubing PE 0.58x0.96mm 0.58 ID 0.96 OD mm
Heparin sodium Leo Laboratories Heparin sodium 1000IU/ml 15 U/ml
Vetbond Tissue Adhesive 3M MVetbond Tissue Adhesive
Monitoring system SA Instruments http://www.i4sa.com Model 1025L monitoring system Monitors respiration and temperature
Pressure transducer Biopac Systems, Inc. BLOOD PRESSURE TRANSDUCER - TSD104A MP150 DATA ACQUISITION SYSTEM - WIN - MP150WSW Monitors blood pressure
RapidLab blood gas analyzer Siemens AG RAPIDLab 248/348 Systems
4.7T animal scanner Agilent Technologies 4.7T frequency 199.845 MHz
MR compatible stereotactic bed m2m Imaging Corp Rat bed: PA Multi element AHS 50-72-1003/100
Coil m2m Imaging Corp Volume TH/Rx RQD1 72/112 200
Fluoxetine Hydrochloride Sigma-Aldrich F-132 5mg/kg in saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  2. Anderson, I. M., McKie, S., Elliott, R., Williams, S. R., Deakin, J. F. Assessing human 5-HT function in vivo with pharmacoMRI. Neuropharmacology. 55, 1029-1037 (2008).
  3. Choi, J. K., Chen, Y. I., Hamel, E., Jenkins, B. G. Brain hemodynamic changes mediated by dopamine receptors: Role of the cerebral microvasculature in dopamine-mediated neurovascular coupling. Neuroimage. 30, 700-712 (2006).
  4. Cohen, Z., Bonvento, G., Lacombe, P., Hamel, E. Serotonin in the regulation of brain microcirculation. Prog. Neurobiol. 50, 335-362 (1996).
  5. Ferrari, L. A robust experimental protocol for pharmacological fMRI in rats and mice. J. Neurosci. Methods. 204, 9-18 (2011).
  6. Gozzi, A. Differential effects of antipsychotic and glutamatergic agents on the phMRI response to phencyclidine. Neuropsychopharmacology. 33, 1690-1703 (2008).
  7. Houston, G. C. Mapping of brain activation in response to pharmacological agents using fMRI in the rat. Magn Reson. Imaging. 19, 905-919 (2001).
  8. Jenkins, B. G., Sanchez-Pernaute, R., Brownell, A. L., Chen, Y. C., Isacson, O. Mapping dopamine function in primates using pharmacologic magnetic resonance imaging. J. Neurosci. 24, 9553-9560 (2004).
  9. Klomp, A. Lasting effects of chronic fluoxetine treatment on the late developing rat brain: age-dependent changes in the serotonergic neurotransmitter system assessed by pharmacological MRI. Neuroimage. 59, 218-226 (2012).
  10. Logothetis, N. K., Pauls, J., Augath, M., Trinath, T., Oeltermann, A. Neurophysiological investigation of the basis of the fMRI signal. Nature. 412, 150-157 (2001).
  11. Martin, C., Sibson, N. R. Pharmacological MRI in animal models: A useful tool for 5-HT research. Neuropharmacology. 55, 1038-1047 (2008).
  12. McKie, S. Neuronal effects of acute citalopram detected by pharmacoMRI. Psychopharmacology (Berl. 180, 680-686 (2005).
  13. Preece, M. A. Evidence that increased 5-HT release evokes region-specific effects on blood-oxygenation level-dependent functional magnetic resonance imaging responses in the rat brain. Neuroscience. 159, 751-759 (2009).
  14. Schwarz, A. J. A stereotaxic MRI template set for the rat brain with tissue class distribution maps and co-registered anatomical atlas: application to pharmacological MRI. Neuroimage. 32, 538-550 (2006).
  15. Schwarz, A. J., Gozzi, A., Reese, T., Bifone, A. In vivo mapping of functional connectivity in neurotransmitter systems using pharmacological MRI. NeuroImage. 34, 1627-1636 (2007).
  16. Sekar, S. Neuroadaptive responses to citalopram in rats using pharmacological magnetic resonance imaging. Psychopharmacology (Berl). 213, 521-531 (2011).
  17. Smith, S. M. Advances in functional and structural MR image analysis and implementation as FSL. NeuroImage. 23, Suppl 1. S208-S219 (2004).
  18. Stark, J. A., McKie, S., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. 5-HT(2C) antagonism blocks blood oxygen level-dependent pharmacological-challenge magnetic resonance imaging signal in rat brain areas related to feeding. Eur. J. Neurosci. 27, 457-465 (2008).
  19. Stark, J. A., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. Functional magnetic resonance imaging and c-Fos mapping in rats following an anorectic dose of m-chlorophenylpiperazine. NeuroImage. 31, 1228-1237 (2006).
  20. Steward, C. A., Marsden, C. A., Prior, M. J., Morris, P. G., Shah, Y. B. Methodological considerations in rat brain BOLD contrast pharmacological MRI. Psychopharmacology (Berl). 180, 687-704 (2005).
  21. Strupp, J. P. Stimulate: A GUI based fMRI Analysis Software Package. NeuroImage. 3, S607 (1996).
  22. Tomasi, D. Methylphenidate enhances brain activation and deactivation responses to visual attention and working memory tasks in healthy controls. Neuroimage. 54, 3101-3110 (2011).
  23. Woolrich, M. W. Bayesian analysis of neuroimaging data in FSL. NeuroImage. 45, S173-S186 (2009).
  24. Worsley, K. J. Statistical analysis of activation images. Functional MRI: An Introduction to Methods. Jezzard, P., Matthews, P. M., Smith, S. M. OUP. (2001).
Pre-klinik araştırma Farmakolojik-meydan fMRI Kullanımı: 5-HT Sistemi Uygulaması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).More

Klomp, A., Tremoleda, J. L., Schrantee, A., Gsell, W., Reneman, L. The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System. J. Vis. Exp. (62), e3956, doi:10.3791/3956 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter