Metoder for å undersøke bidrag fra nasofaryngeal-tilknyttede lymforetikulære vev (NALT) til nasale og systemisk immunresponser av mus til intranasal vaksiner er beskrevet. Vi viser en kirurgisk prosedyre for å etablere en NALT-avhengig mus modell og<em> Ex vivo</em> Kulturer av ekstrahert NALT.
De nasofaryngeal-tilknyttede lymforetikulære vev (NALT) funnet hos mennesker, gnagere og andre pattedyr, bidra til immunitet i nesen bihulene 1-3. Den NALT er to parallelle klokkeformede strukturer som ligger i nesegangene over den harde ganen, og er vanligvis ansett for å være sekundære komponenter av mucosal-assosiert lymfoid system 4-6. Ligger innenfor NALT er diskrete avdelinger av B-og T-lymfocytter ispedd antigen-presentasjon dendrittiske celler 4,7,8. Disse cellene er omgitt av en epitelial celle laget mellomlag med M-celler som er ansvarlig for antigen henting fra slimhinnene flater av luftrørene 9,10. Naive lymfocytter sirkulerer gjennom NALT er klar til å svare på første møter med respiratoriske patogener 7. Mens NALT forsvinne hos mennesker i en alder av to år, Waldeyer ring og tilsvarende strukturert lymfatiske organer fortsette å vedvare throughout liv 6. I motsetning til mennesker, mus beholde NALT gjennom hele livet, og dermed gi en praktisk dyremodell for studier av immunreaksjoner opprinnelse innenfor nasal bihulene 11.
Kulturer av encellede suspensjoner av NALT er ikke praktisk på grunn av lav avkastning av mononukleære celler. Imidlertid kan NALT biologi bli undersøkt av ex vivo dyrking av intakt orgel, og denne metoden har den ekstra fordelen av å opprettholde den naturlige vevet struktur. For in vivo studier, genetiske knockout modeller presentere defekter begrenset til NALT er for øyeblikket ikke tilgjengelig på grunn av en dårlig forståelse av den utviklingsmessige veien. For eksempel, mens lymfotoksin-alfa knockout mus har atrophied NALT, blir Peyer sine lapper, perifere lymfeknuter, follikulære dendrittiske celler og andre lymfevev også endret i disse genetisk manipulert mus 12,13. Som et alternativ til genet knockout mus, kirurgisk ablasjon permanently eliminerer NALT fra nasal passasje uten å påvirke andre vev. Den resulterende mus modell har blitt brukt til å etablere relasjoner mellom NALT og immunresponser mot vaksiner 1,3. Serial samling av serum, spytt, nasale vasker og vaginale sekreter er nødvendig for å etablere grunnlag av verten svar til vaksinasjon, mens immunreaksjoner stammer direkte fra NALT kan bekreftes ved vevskultur. Følgende prosedyrer skissere operasjoner, vev kultur og prøvetaking er nødvendig for å undersøke lokale og systemiske humorale immunresponser til intranasal (IN) vaksinasjon.
Vi har presentert kollektive metoder for å utvikle en dyremodell, skaffe biologiske prøver, og analyser for å undersøke NALT-tilknyttede immunresponser 1-4. Det er flere faktorer å vurdere under utførelsen av disse metodene. Standard sterile teknikker for kirurgi og vev kultur bør følges. En kombinasjon av antibakterielle og soppdrepende midler brukes under isolasjon og kultur, samt opprettholde steriliserte instrumenter, arbeidsområde, og desinfiserte ganespalter vil redusere risikoen for forurensning. Spytt, nasale vasker og lignende mucosal sekret prøver skal inspiseres for å smitte via blod, som serum-antistoffer er vanligvis funnet i høyere konsentrasjoner. Videre bør mucosal sekreter bare litt utvannet for analysen fordi lavere konsentrasjoner av antistoffer er til stede i disse prøvene sammenlignet med serum.
Mus må holdes varm rett etter operasjonen for å preventilere potensiell anestesi-indusert hypotermi. Alternative hvilende musene på sine sider i løpet av postoperative rekonvalesens å minimere uregelmessig åndedrett. Den kirurgiske prosedyren er mer effektiv med tre personer som arbeider sammen for å fullføre disse oppgavene: en utfører operasjonen, en for å bistå i å holde munnen åpen, og en for å gi postoperativ behandling som musene gjenopprette fra anestesi.
Det er nødvendig å bruke H & E farging av kraniale tverrsnitt på slutten av alle eksperimentelle prosedyrer eller undersøkelser for å verifisere suksess for kirurgi for hver mus. Mulige kirurgi utfall er: komplett og bilateral NALT ablasjon, ufullstendig ablasjon, eller intakt NALT. Fordi ikke alle operasjoner vil resultere i fullstendig tap av NALT, dyr med rester eller intakt NALT kan brukes som interne kontroller. En annen potensiell utfallet er at ganen ikke fullstendig helbrede, og etterlot en åpning forbinder nasal og munnhulen. Ufullstendighelbredelse av ganen vil resultere i lav vekt og manglende trives, og disse personene bør fjernes fra studiene.
Undersøke vaksine svar først med mus modell vil tjene til å etablere en rolle for NALT i den tiltenkte undersøkelsen utfallet (antistoffrespons, overlevelse, etc.). Kirurgisk fjerning av NALT forenkler fastsettelse av nasale bidrag til lokal og systemisk immunitet. Den kirurgiske tilnærming som beskrives her er den mest direkte metoden for å få en mus modell blottet for NALT. Velg knock-out mus modeller har blitt rapportert å mangle NALT, men disse dyrene også er mangelfull i cytokiner eller chemokines avgjørende for utviklingen av andre sekundære lymfoide vev, og kan huse flere defekter 12,13. Videre ble de metodene som er beskrevet her er utviklet for å undersøke flere aspekter av immunreaksjoner opprinnelse innenfor nesegangene. Våre eksperimentelle resultatene er basert på studier med hele øvre palate fra musen for vevskultur, selv om det er mulig at deler kan brukes. Endelig er den kultiverte NALT modellen nyttig for å utføre eksperimenter helt i vevskultur.
The authors have nothing to disclose.
Støtte ble gitt av Becton Dickinson Technologies. Synspunkter som uttrykkes i dette brevet er de av forfatterne, og ikke til hensikt å reflektere offisiell politikk av amerikanske myndigheter. Forskningen ble gjennomført i samsvar med dyrevernloven og andre føderale lover og forskrifter knyttet til dyr og eksperimenter som involverer dyr og følger prinsippene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, National Research Council, 1996. Anlegget der denne forskningen ble utført er fullt akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
Surgical Scissors | |||
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
Eosin B | Sigma | 2853 | |
Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |