Summary
描述的方法来检查鼻咽相关淋巴组织（NALT）鼻内疫苗的小鼠鼻腔和全身免疫反应的贡献。我们展示了一个外科手术，以建立一个的NALT依赖鼠标模型，
Abstract
鼻咽相关淋巴组织（NALT）发现，在人类，啮齿动物和其他哺乳动物，有助于在1-3鼻窦的免疫力。 NALT是两个平行的钟形结构位于硬腭以上的鼻腔，通常被认为是粘膜相关淋巴系统4-6二次元件。位于NALT穿插离散B和T淋巴细胞，树突状细胞抗原提呈4,7,8车厢。这些细胞被包围的上皮细胞层间与M-细胞是负责从空中通道9,10粘膜表面的抗原检索。正准备通过NALT循环的幼稚淋巴细胞回应7呼吸道病原体的第一次接触。虽然NALT在人类消失两岁，韦氏环和类似结构的淋巴器官继续坚持日roughout生活6。相反，人类，小鼠保留整个生命NALT，从而提供了一个方便的动物模型，为11鼻窦内的免疫反应的研究。
NALT单细胞悬液的文化是不实际的，由于产量低的单核细胞。然而，NALT生物学可以完整的器官体外培养的研究，该方法具有额外的优势，保持自然的组织结构。 在体内研究，提出限制到NALT缺陷的基因剔除模型是目前没有可由于缺乏了解的发展途径。例如，而淋巴毒素α基因敲除小鼠已萎缩NALT，Peyer氏斑，周围淋巴结滤泡树突状细胞和其他淋巴组织也改变了这些基因操作的小鼠12,13。作为一种替代基因敲除小鼠，手术消融带够永远接受从鼻腔消除NALT，而不影响其他组织。产生的小鼠模型已被用于建立NALT和免疫反应的疫苗1,3之间的关系。串行收集血清，唾液，鼻腔冲洗和阴道分泌物的宿主反应的基础上建立的疫苗，而直接源于NALT的免疫反应，可以通过组织培养证实是必要的。以下步骤概述了手术，组织培养和样品收集必要的检查局部和全身体液鼻腔（IN）的疫苗接种的免疫反应。
Protocol
1。 NALT收集和培养
- 安乐死使用IACUC批准指导的小鼠。避免使用吸入麻醉药可能影响NALT。小鼠转移到无菌工作区或生物安全柜。删除鼠标的下颚和清洁用酒精和碘抹布上腭区。
- 用11号手术刀片，手术刀柄仔细削减和消费上腭，通过鼠标门齿和臼齿的内侧轮廓。
- 轻轻剥开腭钳，小心不要撕的口感。
- 这一步是必要的文化，以减少污染和处理多种口味。地方口味，将在无菌48孔板250μL完全培养基预填充第一列的个别井（37℃）组成的RPMI 1640，辅以10％小牛血清，100μg/ mL链霉素，100 UI / mL青霉素，50微克/毫升庆大霉素1微克/毫升fungizone /两性霉素。媒体应该是缓冲碳酸盐如果口味都在5％的CO 2/95％的潮湿空气培养箱（37℃），或者使用10毫米肝素钠pH值7.4非CO 2文化，培养。
- 要洗的口味，用钳子移动到每个连续行以及口味，仔细攻板之间洗涤，直到腭经历了共8个洗。
- 转移到一个新的无菌48孔板含有250μL新鲜，完整的培养基中井（37℃）的口味。
- 将板含到37℃培养箱培养研究期间的口味。
- 收集无菌转移100μL培养基，从文化的井，每24小时Eppendorf管，更换100μL新鲜培养基，37℃的样品进行分析。
- 离心10分钟，4℃，颗粒碎片380 XG培养基样品。
- 从离心样品上清转移新鲜Eppendorf管和储存在-20°C，直到准备分析。
- 抗原特异性IgG和IgM和IgA，或分泌细胞因子的计量标准酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清组织。
2。外科消融的NALT
- 雌性BALB / c小鼠，7至9周的年龄，是合适的对象，但也接受其他菌株。手术前三天提供凝胶体状湿食品鼠标来替代食物和水，将手术后管理，以适应新环境。
- 管理进入口腔手术前一滴Metacam止痛药（1.5毫克/毫升或0.05毫克/下降）。
- 使用IACUC批准的指导下，例如氯胺酮，乙酰丙嗪，甲苯噻嗪的混合物（KAX），麻醉小鼠和Puralube兽医软膏涂于眼睛，防止干燥。避免使用吸入麻醉药可能影响NALT。一nesthesia可以温柔捏到脚趾反射反应的情况下确认。
- 1 mL生理盐水（0.9％氯化钠注射液USP），皮下管理之间的肩膀刀片，使用1 22-28号针头和注射器，以防止手术后鼠标潜在的脱水。还管理有0.1 mL的Respiram中皮下使用期间和手术后1 22-28号针头和注射器，以促进健康呼吸之间的肩膀刀片。
- 提供热支持鼠标，在随后的所有操作。
- 麻醉鼠标放置在仰卧位，左右上下切牙手术缝合线的两个单独的循环使用，轻轻地撬开了嘴，露出上腭。
- 用11号手术刀片下来的的NALT现场的上腭中线长度约3毫米的切口。
- 切口插入0.5毫米microcurette和下边缘轻轻刮去，以扰乱了NALT。
- 烧灼切口上直热烧灼单位的罚款循环停止出血。
- 继续热鼠标的支持，同时恢复到全意识和活动。
- 用生理盐水皮下注射，最多一天三次，每毫升注射肩胛骨之间，提供鼠标作为必要和口服止痛药，以防止脱水一次手术后3天的日子。确定通过皮肤帐篷测试，以检查皮肤膨脱水。帐篷，以便它掌握的肩膀刀片之间的皮肤和皮毛。如果皮肤迅速恢复到正常的，以前的位置，鼠标不脱水。如果皮肤持续升高，缓缓移动，鼠标是在脱水状态，需要盐水。手术后至少3天为湿的食物，以允许足够的时间恢复。
- 在此之前的任何实验程序，观察跟踪体重增加为8-10天的小鼠。体重恢复不佳通常表示不完全腭裂修复，并进一步研究这些小鼠应撤回。
3。准备组织学NALT和评估的NALT手术成功
- NALT手术的成功，必须是经组织学检查确定如下所述。完成后，所有的实验研究，准备颅集合小鼠安乐死使用批准IACUC指导。避免使用吸入麻醉药可能影响NALT。
- 掌握的安乐死鼠标的脖子的后颈。通过双方的剪刀剪断髁过程，从其余的头骨的下颌。
- 颈背开始，从头骨的皮肤和皮毛，对头盖骨的腹部慢慢地剥离和切割。
- 小心取出鼻腔周围地区的皮肤剪掉尖吻皮肤完全消除。
- 脱离头骨，椎骨的机智公顷的剪刀剪断。
- 枕骨大孔插入剪刀和削减一半沿中线向下头盖骨允许渗透到福尔马林中固定的软组织。
- 修复头盖骨在10％中性福尔马林（NBF）在室温下24小时。
- 除垢，将样品和单独的磁带，在纱布包裹，以防止接触骨头，在与甲酸混合瓶Rexyn。在室温下12小时的孵育，然后自来水下冲洗约20分钟不断。
- 修剪样品隔过去的眼眶，用刀片。
- 样品和磁带可存储10％为短期NBF。
- 放置到一个通宵处理组织的处理器的样品。这是从样品准备石蜡包埋水。
- 删除处理的组织，在蜡块嵌入一个吻下来，并使其冷却。
- 修剪ŕough 15微米块与自动切片机，接近NALT的大致位置，横截面，然后继续削减到玻片上安装在44.3℃水浴中5微米的部分。
- 应采用苏木精伊红（H＆E）组织学染色评估NALT消融。
4。从老鼠的生物样品的收集
4.1血清
- 仔细热灯体温升高，血流量就会增加。外科刀片刻痕尾静脉采集血液。让血液滴成Microtainer血清分离器管自由。
- 尼克用吸水材料，如纱布或毛巾，应用温和的压力，以阻止血液流动。
- 允许在30分钟Microtainers的血液凝固，然后离心之间的6-15×1000Ğ为至少90秒。
- 权]血清中分离到一个干净的Eppendorf管从Microtainer贮存于-80°C。
4.2唾液
- 持有麻醉鼠标垂直，同时吸取20-30μL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）之间的脸颊和牙龈线。收集枪头指导脸颊和牙龈线之间，稀释唾液。
- 转让稀释的唾液含有10μL的2倍蛋白酶抑制剂和存储于-20°C到一个新的管
4.3鼻腔分泌物
- 安乐死之前收集鼻腔分泌物的鼠标，使用核准IACUC指导。避免使用吸入麻醉药可能影响NALT。
- 垂直握着鼠标，认真吸取30μL无菌PBS在一个鼻孔，收集从其他鼻孔冲洗。
- 转让冲洗含有10μL的2倍蛋白酶抑制剂和存储于-20°C到一个新的管
4.4阴道分泌物
- 微量的尖端插入到日开幕é一个安乐死鼠标外阴，50μL无菌PBS冲洗阴道，并收集所有的液体微量。
- 转让冲洗含有10μL的2倍蛋白酶抑制剂和存储于-20°C到一个新的管
5。抗原特异性抗体或细胞因子，在收集的样本，用ELISA或其他定量方法可以测量。
6。代表结果
图1提供了一个体外分析与处理的NALT含组织所涉及的步骤的一般原理。在图2（甲，乙），腭裂的大小，以及消融手术切口在（A）的位置，如虚线所示。 NALT位置，在区域对切除苏木染腭图2（c）并行的组织，臼齿的箭头表示。
图3提出的NALT中断手术的步骤，显示访问到NALT上腭（甲，乙），消融（三），并最终烧灼切口（四）曝光。一个典型的H＆E的术前鼻窦周围NALT面积截面显示在图3E，而NALT由microcurette的破坏，直接手术后的图像出现在图3F。允许有足够的时间从手术休养，应关闭切口，鼻腔缺乏NALT（ 图3G）。
通过使用这些技术获得了典型的实验结果如图4所示，从比较研究的金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗（STEBVax）组织培养上清液和生物样品。小鼠滴鼻（IN）或腹腔内（IP）路由管理STEBVax。制定疫苗与佐剂激活的Toll样受体4通路3,1 4，和控制，只有生理盐水或疫苗无佐剂。从实验组获得的培养NALT分泌到培养基中，是衡量用ELISA抗原特异性免疫球蛋白。在这个例子中（ 图4A），结果表明，IGA的最大数额从与辅助相结合的亚单位疫苗接种在小鼠实验中获得的NALT发布。
可以用来控制或NALT小鼠获得的生物样品（如血清，唾液，鼻腔分泌物，阴道分泌物） 在体内的免疫反应与组织培养的结果比较，以鼻抗原来分析。 图4b，IgA和IgG反应的疫苗接种，大大减少无功能NALT。抗原特异性IgA水平普遍高于中IgG免疫小鼠的黏膜分泌物（唾液，鼻腔冲洗）。
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图1。NALT收集和体外培养的原理图。
图2可视鼠标腭表示NALT和手术切口的位置。由虚线表示（一）手术切口的上腭，上腭切除（B）或苏木（三）染色，以查看在上颚臼齿区（前侧腭染色暗紫色的并行NALT的大小和位置）。 NALT用箭头表示。
图3。手术NALT中断。的NALT中断手术：仰卧鼠标上腭手术前视图（A），上腭中线切口访问NALT（二）; microcurette探头通过正中切口插入扰乱NALT结构，关键阶段tegrity（C），（四）手术结束切口烧灼。鼻腔，手术前，H＆E染色（五），显微图像后立即手术（女）;并成功治愈，无NALT鼠标（G）的。
图4。疫苗的具体NALT培养，唾液，鼻腔分泌物和收集免疫小鼠的抗体。 NALT免费或正常对照组小鼠接种或IP与STEBVax，生物样品采集。一式三份样本的抗体水平，用ELISA法测定。 （一），NALT被删除从对照组（不手术操作）和培养检查抗体反应。疫苗的特异性IgA文化反应在接种疫苗的老鼠（学生t检验，P≤0.01，比无佐剂或没有疫苗）的统计，从不同的控制。 （二）NALT干扰大大降低了特异性抗体反应疫苗接种。有特异性抗体水平显着差异NALT和NALT组唾液IgG的结果（学生t检验，P≤0.05）以外的所有比较（无外科手术或控制）。
Discussion
我们已经提出了发展动物模型的集体方法，取得生物样品，分析和研究的NALT相关免疫反应1-4。有其他因素考虑，在这些方法的性能。应遵循标准的无菌技术，手术和组织文化。隔离和文化，以及保持消毒仪器，工作区和消毒口味过程中使用的抗菌和抗真菌剂的组合将减少污染的风险。唾液，鼻洗涤和类似的粘膜分泌物标本应为潜在污染的血液检查，发现高浓度一般都在血清抗体。此外，粘膜分泌物应该只被轻微稀释分析，因为低浓度的抗体，这些样本中血清相比。
小鼠直接手术后必须保持温暖预发泄潜在的麻醉诱导低温。在其两侧交替休息小鼠手术后休养期间尽量减少不规则的呼吸。手术过程是三个人一起工作来完成这些任务更有效执行手术，协助举办着嘴，提供手术后护理的小鼠从麻醉中恢复。
这是需要使用颅截面H＆E染色，在所有实验程序或研究，以验证每个鼠标的手术成功结束。可能手术的结果是：完整的和双边的NALT消融，消融不全，或完整NALT。因为并非所有的手术将导致NALT，完全丧失残留或完整NALT动物可作为内部控制。另一个潜在的结果是，口感未能彻底治愈，留下了一个开放连接鼻腔和口腔。不完整腭愈合会导致低体重和未能茁壮成长，这些人应该从研究中删除。
检查疫苗的反应，先用小鼠模型，将有助于建立在预期的研究成果（抗体反应，生存等）为NALT的作用。手术切除的NALT局部和全身免疫促进鼻贡献的决心。这里所描述的手术方法是最直接的方法获得NALT缺乏的小鼠模型。选择敲除小鼠模型已报告缺乏NALT，但这些动物也有缺陷，在其他二级淋巴组织的发展至关重要的细胞因子或趋化因子，并可能含有额外的缺陷12,13。此外，这里所描述的方法进行检查鼻腔内的免疫反应的几个方面。使用整个上palat研究基于我们的实验结果E从组织文化的鼠标，虽然它是可能的，可用于部分。最后，培养的NALT模型是进行组织培养试验完全。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
碧迪技术提供了支持。在本文件中所表达的意见是作者的，不旨在反映美国政府的官方政策。符合动物福利法“和其他联邦法规和规章，有关涉及动物和实验动物和以实验动物护理和使用 ，国家研究理事会，1996年” 指南 “中所列的原则，坚持进行研究。本研究进行了设施是完全认可的实验室动物保健国际评估和认证协会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
| Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
| 48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
| Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
| Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
| Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
| Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
| Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
| Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
| Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
| 0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
| Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
| TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
| Surgical Scissors | |||
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
| Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
| Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
| Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
| Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Mayer's Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
| Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
| Eosin B | Sigma | 2853 | |
| Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
| Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |
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