Fremgangsmåder til at undersøge bidrag nasopharyngeal-associerede lymforetikulære væv (NALT) til nasal og systemiske immunresponser i mus til intranasale vacciner er beskrevet. Vi viser et kirurgisk indgreb for at etablere et NALT-afhængig musemodel og<em> Ex vivo</em> Kulturer af ekstraheret NALT.
De nasopharyngeal-associerede lymforetikulære væv (NALT) hos mennesker, gnavere, og andre pattedyr, bidrager til immunitet i de nasale bihuler 1-3. Den NALT to parallelle klokkeformede strukturer placeret i næsepassagerne ovennævnte den hårde gane og sædvanligvis betragtes som sekundære komponenter i slimhinde-associerede lymfoide system 4-6. Placeret inden i NALT er diskrete segmenter af B-og T-lymfocytter indflettet med antigen-præsenterende dendritiske celler 4,7,8. Disse celler er omgivet af en epithelcellelaget interkaleret med M-celler, som er ansvarlige for antigen hentning fra slimhindeoverfladerne i luftvejene 9,10. Naive lymfocytter cirkulerer gennem NALT er klar til at reagere på de første møder med respiratoriske patogener 7. Mens NALT forsvinder i mennesker i en alder af to år, Waldeyer ring og tilsvarende struktureret lymfeorganer Der er fortsat throughout levetid 6. I modsætning til mennesker fastholde mus NALT hele livet, hvilket således tilvejebringer en bekvem dyremodel til undersøgelse af immunreaktioner oprindelse i de nasale bihuler 11.
Kulturer af enkelt-cellesuspensioner af NALT er ikke praktisk på grund af lave udbytter af mononukleære celler. Imidlertid kan NALT biologi undersøges ved ex vivo dyrkning af den intakte organ, og denne fremgangsmåde har den yderligere fordel at opretholde den naturlige vævsstruktur. For in vivo studier, er genetiske knockout-modeller udgør defekter begrænset til NALT i øjeblikket ikke tilgængelig på grund af en dårlig forståelse af udviklingsvejen. For eksempel, mens lymphotoxin-a-knockout-mus har atrofieret NALT er de Peyerske plaques, perifere lymfeknuder, follikulære dendritiske celler og andre lymfoide væv også ændres i disse genetisk manipulerede mus 12,13. Som et alternativ til gen-knockout-mus, kirurgisk ablation permanently eliminerer NALT fra nasal passage uden at påvirke andre væv. Den resulterende musemodel er blevet anvendt til at etablere forholdet mellem NALT og immunresponser på vacciner 1,3. Seriel indsamling af serum, spyt, nasale vaske og vaginale sekreter er nødvendig for at skabe grundlag for værtsresponser til vaccination, mens immunresponset oprindelse direkte fra NALT kan bekræftes ved vævskultur. Følgende procedurer skitsere de operationer, vævskultur og prøvetagning er nødvendige for at undersøge lokale og systemiske humorale immunrespons til intranasal (IN) vaccination.
Vi har præsenteret kollektive fremgangsmåder til udvikling af en dyremodel, opnåelse biologiske prøver, og assays til undersøgelse NALT-associerede immunresponser 1-4. Der er yderligere faktorer til at overveje, under udførelsen af disse metoder. Standard sterile teknikker til kirurgi og vævskultur bør følges. En kombination af antibakterielle og svampedræbende midler, der anvendes under isolation og kultur, samt opretholdelse af steriliserede instrumenter, arbejdsområde og desinficerede ganer vil reducere risikoen for forurening. Spyt, nasal vaske og lignende mucosa-sekretion prøver bør undersøges for mulig kontaminering med blod, som serumantistoffer generelt fundet i højere koncentrationer. Endvidere bør slimhindesekreter kun svagt fortyndet til analyse på grund af lavere koncentrationer af antistoffer er til stede i disse prøver sammenlignet med serum.
Mus holdes varme umiddelbart efter operation for at præudlufte potentiale anæstesi-induceret hypotermi. Alternative hvile mus på deres sider under post-kirurgi rekreation for at minimere uregelmæssig respiration. Den kirurgiske procedure er mere effektiv med tre personer, der arbejder sammen om at udføre disse opgaver: en udfører operationen, en til at hjælpe med at holde munden åben, og en til at give efter kirurgisk behandling, som musene komme fra bedøvelsen.
Det er nødvendigt at bruge H & E farvning af kranie tværsnit i slutningen af alle eksperimentelle procedurer eller undersøgelser for at kontrollere succes operationen for hver mus. Mulige kirurgi resultater er: komplet og bilaterale NALT ablation, ufuldstændige ablation, eller intakt NALT. Fordi ikke alle operationer vil resultere i fuldstændig tab af NALT dyr med residual eller intakt NALT kan anvendes som interne kontroller. En anden potentiel resultat er, at ganen ikke fuldstændigt at helbrede, efterlader en åbning forbinder nasale og orale hulrum. Ufuldstændigheling af ganen vil resultere i lav vægt og manglende trivsel, og disse personer bør fjernes fra undersøgelser.
Behandlingen vaccine responser først med musemodellen vil tjene til at etablere en rolle for NALT i den tilsigtede undersøgelsen resultatet (antistofrespons, overlevelse, etc.). Kirurgisk fjernelse af NALT letter bestemmelsen af nasale bidrag til lokal og systemisk immunitet. Den kirurgiske fremgangsmåde, der beskrives her, er den mest direkte fremgangsmåde til opnåelse af en musemodel uden NALT. Vælge knock-out mus-modeller er blevet rapporteret at manglen NALT, men disse dyr også er deficiente i cytokiner eller chemokiner er afgørende for udvikling af andre sekundære lymfevæv, og kan huse yderligere fejl 12,13. Yderligere blev de her beskrevne metoder udviklet til undersøgelse af adskillige aspekter af immunresponser oprindelse i næsepassagerne. Vore eksperimentelle resultater er baseret på undersøgelser under anvendelse af hele den øvre palate fra mus til vævsdyrkning, selv om det er muligt, at sektionerne kan anvendes. Endelig dyrkede NALT model er anvendelig til udførelse af eksperimenter fuldstændigt i vævskultur.
The authors have nothing to disclose.
Der blev leveret af Becton Dickinson Technologies. Synspunkterne i denne underkastelse er dem af forfatterne og ikke foregiver at afspejle officielle politik den amerikanske regering. Forskningen blev udført i overensstemmelse med dyreværnsloven og andre føderale love og regler vedrørende dyr og eksperimenter, der involverer dyr og tiltræder principperne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, National Research Council, 1996. Den facilitet, hvor denne forskning er udført er fuldt akkrediteret af Association for vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care International.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
Surgical Scissors | |||
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
Eosin B | Sigma | 2853 | |
Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |