鼻腔内ワクチンマウスの鼻腔内および全身の免疫応答に鼻咽頭関連リンパ細網組織(NALT)の寄与を調べるためのメソッドが記述されています。我々はNALTに依存するマウスモデルを確立するために外科手術を発揮し、<em> ex vivoで</em抽出されたNALTの>文化。
人間、齧歯類、および他の哺乳動物に見られる鼻咽頭関連リンパ細網組織(NALT)が、1月3日副鼻腔内免疫に貢献しています。 NALTは、硬口蓋、上記の鼻腔にある2つの平行な釣鐘型の構造であり、通常、粘膜関連リンパ系4-6の二次成分であると考えられている。 NALT内に位置し、抗原提示樹状細胞4,7,8が点在し、BおよびTリンパ球の離散的コンパートメントである。これらの細胞は、空気通路9,10の粘膜表面から抗原検索のための責任があるM細胞にインターカレートした上皮細胞層に囲まれています。 NALTを介して循環するナイーブリンパ球は、呼吸器病原体7で最初の出会いに対応するために態勢を整えています。 NALTは2歳で人間に消えている間、ワルダイヤー輪と同様に構造化されたリンパ器官は目を保持し続けるライフ6 roughout。人間とは対照的に、マウスは、このように副鼻腔11内に元の免疫応答の研究のための便利な動物モデルを提供し、生涯を通じてNALTを保持します。
NALTの単細胞懸濁液の培養は、単核細胞の収率が低いために実用的ではありません。しかし、NALT生物学は、無傷の器官のex vivoで培養することにより検討し、このメソッドは自然な組織構造を維持するための付加的な利点を持っていることができます。 in vivo試験では、NALTに限ら欠陥を提示する遺伝子ノックアウトモデルでは、発達経路の理解不足のため現在利用できません。リンホトキシン-αノックアウトマウスはNALTが萎縮している一方、例えば、パイエル板、末梢リンパ節、濾胞樹状細胞やその他のリンパ組織はまた、これらの遺伝子操作マウスを12,13に変更されています。遺伝子ノックアウトマウスの代わりに、外科的アブレーションのpとして常に承認、他の組織に影響を与えることなく、鼻腔からNALTを排除します。その結果マウスモデルは、ワクチン1,3にNALTと免疫応答の間の関係を確立するために使用されています。血清、唾液、鼻洗浄と膣分泌物のシリアルコレクションは、NALTから直接発信免疫応答は組織培養によって確認することができますが、予防接種へのホストの応答の基礎を確立するために必要である。次の手順では、鼻腔(IN)ワクチン接種局所および全身体液性免疫応答を検討するために必要な手術は、組織培養とサンプルコレクションの概要を説明します。
我々は、生物学的サンプル、NALTに関連した免疫応答の1-4を調べるためのアッセイを得て、動物モデルを開発するための集団的方法を提示している。これらのメソッドの実行中に考慮すべきその他の要因があります。手術や組織培養のための標準無菌テクニックに従うべきである。単離および培養と同様に、滅菌した器具、作業領域、および消毒味覚を維持する時に使用される抗菌剤および抗真菌剤の組み合わせは、汚染の危険性を減らすことができます。血清抗体は一般的に高い濃度で検出されたとして唾液、鼻洗浄と同じような粘膜分泌物のサンプルは、血液中の潜在的な汚染を検査する必要があります。抗体の低濃度は、血清に比べ、これらのサンプル中に存在するので、さらに、粘膜の分泌物は、ほんの少しだけ分析のために希釈する必要があります。
マウスは、事前に直接、手術後に保温する必要があります潜在的な麻酔誘発性低体温を発散。不規則な呼吸を最小限に抑えるために手術後の療養中に、その両側に別の安静時のマウス。手術を行う1、口を開けて、マウスは麻酔から回復するように手術後のケアを提供するための1つを保持して支援するためにいずれかの手術では、これらのタスクを完了するために一緒に仕事を3人の方が効率的です。
これは、各マウスの手術の成功したかどうかを確認するために、すべての実験手順や研究の終了時に頭蓋の断面のH&E染色を使用する必要があります。可能な限り手術の成果は、以下のとおりです。完全な二国間のNALTアブレーション、不完全切除、または無傷のNALT。すべての手術は、NALTの完全な損失になりますので、残留または無傷のNALTを持つ動物は、内部コントロールとして使用することができます。別の潜在的な結果は、口蓋、鼻と口腔をつなぐ開口部を残して、完全に治癒してしまうことである。不完全口蓋の治癒は、低体重と成長障害が発生し、これらの個人は、研究から削除する必要があります。
マウスモデルを持つ最初のワクチンの応答を調べると、意図した研究結果(抗体応答、生存率など)にNALTの役割を確立するのに役立つでしょう。外科的にNALTを削除すると、ローカルおよび全身性免疫に鼻の貢献の決定を容易にします。ここで説明した外科的アプローチは、NALTの欠けているマウスモデルを得るための最も直接的な方法です。選択したノックアウトマウスモデルが欠けてNALTに報告したが、これらの動物はまた、他の二次リンパ組織の発達に不可欠なサイトカインやケモカインの欠乏であり、追加の欠陥12,13を抱いていることがされています。さらに、ここで説明する方法は、鼻腔内に元の免疫応答のいくつかの側面を調べるために開発されました。我々の実験結果は、全体の上限palatを用いた研究に基づいています。組織培養のためのマウスからの電子、それはセクションが使用されている可能性がありますが。最後に、培養されたNALTモデルは、組織培養で完全に実験を行うのに便利です。
The authors have nothing to disclose.
サポートは、ベクトン·ディッキンソンの技術によって提供されました。この申請において示された見解は著者のものであり、米国政府の公式方針を反映するように意図されません。研究は、動物福祉法と実験動物のケアと使用するためのガイド 、国家研究評議会、1996年に述べた原則に動物や付着を伴う動物実験に関連する他の連邦法および規制を遵守して実施されました。本研究が実施された施設は完全に実験動物ケア·インターナショナルの評価と認定協会の認定を受けています。
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
Surgical Scissors | |||
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
Eosin B | Sigma | 2853 | |
Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |