비강 백신에 대한 생쥐의 비강 및 전신 면역 반응에 nasopharyngeal – 관련 lymphoreticular 조직 (NALT)의 공헌을 검사하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 NALT 종속 마우스 모델을 수립하기 위해 수술을 발휘하고<em> 예 생체내</em추출 NALT의> 문화.
인간, 설치류, 그리고 다른 포유류에서 발견 nasopharyngeal – 관련 lymphoreticular 조직 (NALT)는, 1-3 비강 sinuses의 면책 특권에 기여한다. NALT는 하드 구개 위의 비강에에 두개의 평행 종 모양의 구조물이며, 일반적으로 점막 – 관련 림프 시스템 4-6의 보조 구성 요소로 간주됩니다. 돌기 세포에게 4,7,8를 항원 제시와 함께 interspersed B 및 T lymphocytes의 이산 구획은 NALT 내에 위치하고 있습니다. 이러한 전지는 공기 통로 9,10의 점막 표면에서 항원 검색에 대한 책임은 M-세포와 intercalated 상피 세포 레이어로 둘러싸여있다. NALT 통해 순환 나이브 lymphocytes는 호흡기 병원균 7 첫번째 조우에 대응하기 위해 서 있습니다. NALT 두 세 의해 인간 사라지는 동안 Waldeyer의 반지와 마찬가지로 구조화된 림프 기관은 일을 지속 계속생활 6 roughout. 인간와는 달리, 생쥐 따라서 비강 sinuses 11 이내에 발생하는 면역 반응 연구를위한 편리한 동물 모델을 제공하고, 생명에 걸쳐 NALT을 유지합니다.
NALT의 단일 세포 현탁액의 문화로 인해 mononuclear 세포의 낮은 수율에 대한 실용적 없습니다. 그러나 NALT 생물학은 그대로 기관의 전직 생체내의 culturing을 면밀히 검토하고,이 방법은 자연적인 조직 구조를 유지하는 추가적인 장점을 가지고 있습니다. 생체내 연구에 들어 NALT하도록 제한 결함을 보여주고 유전자 녹아웃 모델은 개발 경로의 가난한 이해로 인해 현재는 사용할 수 없습니다. 림프 독소-α 녹아웃 마우스는 NALT을 위축시키는 반면, 예를 들어, Peyer의 패치, 주변 림프절, follicular의 돌기 세포 및 다른 림프 조직은 또한이 유전자 조작 생쥐 12,13으로 변경됩니다. 유전자 녹아웃 마우스에 대한 대안, 수술 절제 P로ermanently 다른 조직에 영향을주지 않고 비강 통로에서 NALT을 없애줍니다. 그 결과 마우스 모델은 백신 1,3에 NALT와 면역 반응 간의 관계를 설정하는 데 사용되었습니다. 혈청, 타액, 비강 세차장과 질 분비물의 시리얼 컬렉션 NALT에서 직접 발생하는 면역 반응은 조직 배양에 의해 확인할 수 있습니다 반면, 예방 접종에 호스트 응답의 기초를 확립 필요합니다. 다음 절차는 필요 수술, 조직 문화 및 샘플 수집은 비강 (IN) 예방 접종에 대한 로컬 및 조직의 체액성 면역 반응을 조사하기 위해 설명합니다.
우리는 생물 학적 샘플 및 NALT – 관련 면역 반응에게 1-4 조사를위한 assays를 얻어, 동물 모델을 개발하기 위해 집단적 방법을 제시했습니다. 이러한 방법의 성능 기간 동안 고려해야 할 추가적인 요인이 있습니다. 수술 및 조직 배양을위한 표준 무균 기법을 따라야한다. 격리와 문화뿐만 아니라 소독기구, 작업 공간, 그리고 감염되지 않았소 입맛을 유지하는 동안 사용되는 항균 및 antifungal 대리인의 조합은 오염의 위험을 훨씬 줄일 수 있습니다. 혈청 항체는 일반적으로 높은 농도에서 발견되는대로 타액, 비강 세차장 및 유사한 점막 분비 샘플은 피로 잠재적인 오염 물질에 대한 검사를해야합니다. 항체의 낮은 농도는 혈청에 비해 이러한 샘플에 존재하기 때문에 또한, 점막 분비물은 약간 분석을 위해 희석되어야한다.
마우스는 사전에 직접 수술 후에 따뜻한 보관해야합니다잠재적인 마취 유도된 저체온증을 빼낼. 그들의 측면에서 대체 휴식 마우스는 수술 후 회복 기간 동안 불규칙한 호흡을 최소화합니다. 수술은 이러한 작업을 완료하기 위해 함께 일하는 세 개인가 더 효율적이다 : 쥐가 마취에서 회복으로 수술을 수행하는 하나 입을 열어 쥐고을 지원 하나, 그리고 하나는 사후 수술 치료를 제공합니다.
그것은 각각의 마우스에 대한 수술의 성공 여부를 확인하기위한 모든 실험 과정이나 연구 끝에 두개골 크로스 섹션의 H & E 염색법을 사용해야합니다. 가능한 수술 결과는 다음과 같습니다 완전하고 양국 NALT 절제, 불완전 절제하거나 손상되지 NALT. 모든 수술이 잔류하거나 그대로 NALT 갖춘 NALT 손실, 동물 얻을 수 있기 때문에이 내부 통제로 사용될 수 있습니다. 또 다른 잠재적인 결과는 구개는 비강 및 구강 충치를 연결 개통을 떠나, 완전히 치유하는 데 실패한다는 것입니다. 불완전한구개의 치유는 낮은 무게와 번성하는 고장의 원인이되며, 이러한 개인들은 연구에서 제외되어야한다.
마우스 모델 첫번째 백신 반응을 검사하는 것은 의도된 학습 결과 (항체 반응, 생존 등)에 NALT위한 역할을 확립하기 위해이 될 것입니다. 수술 NALT를 제거하면 로컬 및 전신 면역로 비강 기부의 결정을 용이하게합니다. 여기에 설명된 수술 접근법 NALT을 찾아볼 수없는이 마우스 모델을 얻기위한 가장 직접적인 방법입니다. 노크 아웃 선택 마우스 모델은 부족 NALT에게보고하지만,이 동물은 또한 크린 시토킨 또는 기타 보조 림프 조직의 발전에 필수적인 chemokines에 결함이며, 추가적인 결함에게 12,13을 품다 수있다. 또한, 여기에 설명된 방법은 비강 내에 발생하는 면역 반응의 여러 측면을 검토하기 위해 개발되었다. 우리의 실험 결과는 전체 상위 palat을 사용하여 연구를 기반으로조직 배양을위한 마우스에서 전자, 그것이 섹션 사용할 수있다는 것을 가능하지만. 마지막으로, 교양 NALT 모델은 조직 문화에 완전히 실험을 수행하는 데 유용합니다.
The authors have nothing to disclose.
지원 Becton 디킨슨 기술에 의해 제공되었다. 이 제출로 표현 전망 저자 분들이며 미국 정부의 공식 정책을 반영하는 취지하지 않습니다. 연구는 동물 복지 법령 및 동물 실험 동물의 관리 및 사용, 국립 연구 협의회, 1996을위한 가이드에 명시된 원칙을 준수를 포함한 동물 실험에 관련된 다른 연방 법령과 규정을 준수 실시되었다. 본 연구가 실시되었다 시설은 실험실 동물 케어 인터내셔널의 평가와 인증을위한 협회 완전히 인정하고 있습니다.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
Surgical Scissors | |||
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
Eosin B | Sigma | 2853 | |
Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |