Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Påvisning af bakterier under anvendelse Fluorogene DNAzymes

doi: 10.3791/3961 Published: May 28, 2012

Summary

Vi har for nylig rapporteret om en ny tilgang til at generere fluorogene DNAzyme sonder, der kan anvendes til at oprette en enkel, "mix-and-læser" fluorescenstest for påvisning af bakterier. Disse særlige DNA-prober katalyserer spaltningen af ​​en chromophor-modificeret DNA-RNA-kimær substrat i nærvær af rå ekstracellulært blanding (CEM) fremstillet ved en specifik bakterie, hvorved omsætte bakteriel detektion i fluorescenssignal generation. I denne rapport vil vi beskrive de vigtigste eksperimentelle procedurer, hvor et bestemt DNAzyme sonde betegnes "RFD-EC1" er anvendt til påvisning af modellen bakterie,

Abstract

Udbrud knyttet til fødevarebåren og hospitalserhvervede patogener højde for millioner af dødsfald og indlæggelser samt kolossale økonomiske tab hvert eneste år. Forebyggelse af sådanne udbrud og minimering af konsekvenserne af en igangværende epidemi sted en stadig stigende efterspørgsel efter de analysemetoder, der nøjagtigt kan identificere synderen patogener på den tidligste fase. Selv om der er en bred vifte af effektive metoder til påvisning af patogener, kan ingen af ​​dem opfylder alle de følgende fem førende krav indeholdt i en ideel påvisningsmetode: høj specificitet (detektere kun bakterie af interesse), høj følsomhed (i stand til at opdage så lavt som en enkelt levende bakteriecelle), kort tid-til-resultater (minutter til timer), stor operationelle enkelhed (ikke behov for langvarige prøveudtagningsprocedurer og brug af specialudstyr), og omkostningseffektivitet. For eksempel er traditionelle mikrobiologiske metoder højspecifik men kræver en lang tid (days til uger) at opnå et endeligt resultat. 1 PCR-og antistof-baserede teknikker giver kortere ventetider (timer og dage), men de kræver anvendelse af dyre reagenser og / eller sofistikeret udstyr. 2-4 Der er derfor stadig stor efterspørgsel på videnskabelig forskning i retning af udviklingen af ​​innovative bakterielle påvisningsmetoder, der giver forbedrede egenskaber i en eller flere af de ovennævnte krav. Vores laboratorium er interesseret i at undersøge potentialet i DNAzymes som en ny klasse af molekylære prober for biosensorer applikationer, herunder påvisning af bakterier. 5

DNAzymes (også kendt som deoxyribozymes eller DNA-enzymer), er syntetiske enkeltstrengede DNA-molekyler med evnen til at katalysere kemiske reaktioner 6-8 Disse molekyler kan isoleres fra et bredt tilfældig sekvens DNA pulje (som indeholder så mange som 10 16 individuelle sekvenser) ved en proces, der kaldes "in vitro selektion" or "SELEX" (systematisk evolution af ligander ved eksponentiel berigelse). 9-16 Disse specielle DNA-molekyler er blevet bredt undersøgt i de seneste år som molekylære værktøjer til biosensorer anvendelser 6-8

Vores laboratorium har etablerede in vitro-udvælgelse for isolering af RNA-spaltende fluorescerende DNAzymes (RFDs. Figur 1) og undersøgt anvendelsen af RFDs som analytiske værktøjer 17-29 RFDs katalyserer spaltning af et DNA-RNA-kimær substratet ved en enkelt ribonukleotid. junction (R), som er flankeret af en fluorofor (F) og en quencher (Q). Den tætte nærhed af F-og Q gør det uspaltede substrat minimal fluorescens. Imidlertid spaltningshændelse fører til adskillelse af F-og Q, som er ledsaget af signifikant forøgelse af fluorescensintensitet.

For nylig har vi udviklet en fremgangsmåde til isolering af RFDs til bakteriel detektion. 5 Disse særlige RFDs blev isoleret til "lyser "i nærværelse af den rå ekstracellulære blanding (CEM) efterladt af en specifik type af bakterier i deres miljø eller i medierne de dyrkes (fig. 1). Anvendelse af rå blanding omgår omstændelig proces til oprensning og identificere en passende mål fra mikrobe af interesse for biosensor udvikling (hvilket kan tage måneder eller år at fuldføre). Brugen af ​​ekstracellulære mål betyder, at analysering proceduren er enkel, fordi der ikke er behov for foranstaltninger til at indhente intracellulære mål.

Ved hjælp af ovennævnte fremgangsmåde, har vi opnået en RFD der spalter dens substrat (FS1. Figur 2A) kun i nærvær af CEM fremstillet af E. coli (CEM-EF). 5 Denne E. coli-sensing RFD, kaldet RFD-EC1 (fig. 2A), blev fundet at være strengt reagerer på CEM-EF men nonresponsive til CEMS fra en lang række andre bakterier (fig. 3).

Her Present de centrale eksperimentelle procedurer for etablering E. coli påvisningsanalyser med RFD-EC1 og repræsentative resultater.

Protocol

1. Udarbejdelse af Chemical Solutions

  1. 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA): I en 2 liter (L) plastbæger afvejes 186,1 g EDTA (EM Science), og der tilsættes 800 ml (mL) af autoklaveret deioniseret, destilleret vand (ddH2O). PH indstilles til 8,0 med NaOH-pellets (EM Science). Gør det endelige volumen til 1 L under anvendelse af Ddh 2 O. Overfør opløsningen til glasflasker og autoklaven og opbevares ved 4 ° C.
  2. 10 x Tris-borat-EDTA-opløsning (10 x TBE, 89 mM Tris, 89 mM borsyre, 2 mM EDTA, pH 7,5): Afvej 432 g Tris-base (BioShop Canada) og 220 g borsyre (BioShop Canada) og tilføje hver især en 4 L plastbæger. Måle 80 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) og tilsættes til bægerglasset. Tilsættes ddH2O til et slutvolumen på 4 L. blandes grundigt opløsning med en magnetisk omrørerstav, indtil komponenterne er fuldstændig opløst. Overfør opløsningen til glasflasker og autoklaven og opbevares ved 4 ° C.
  3. 10% denaturerende polyacrylamide gel lager: Til en 4 L plastbæger, 1681,7 g urinstof (BioShop Canada), 400 ml 10 x TBE, 1 liter 40% acrylamid / bisacrylamid (29:1)-opløsning (BioShop Canada) tilsættes. Juster lydstyrken til 4 L med Hedeselskabet 2 O. Opløs urinstof under omrøring. Opløsningen overføres til 1 liter ravgule glasflasker og opbevar ved 4 ° C. (Forsigtig! Acrylamid skal håndteres med handsker, maske, beskyttelsesbriller og laboratoriekittel, fordi det er en nervegift før polymerisering).
  4. 2 × gel loading-buffer (2 x GLB): Til en 200 mL bægerglas, og der tilsættes 44 g urinstof, 8 g saccharose (BioShop Canada), 10 mg bromphenol blå (BioShop Canada), 10 mg xylenecyanol FF (Sigma -Aldrich), 400 pi 10% natriumdodecylsulfat (SDS; BioShop Canada), og 4 ml 10 x TBE. Indstille slutvolumenet til 40 ml med ddH2O og opløse faststofferne med mild opvarmning (50 ° C) og omrøring med en magnetisk stang. Overfør 1 ml aliquot i 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved 4 ° C. Baseret på voreserfaring, er det nødvendigt at varme 2 × GLB kortvarigt ved 90 ° C før brug, fordi 2 × GLB størkner under opbevaringen.
  5. 1 M Tris-HCl (pH 7,5): Afvej 12,1 g Tris-base i et 200 ml glasbæger. 60 ml ddH2O og opløse faststofferne ved omrøring med en magnetomrører. PH indstilles til 7,5 med 1 M HCI (Sigma-Aldrich). Der fyldes op til 100 ml med Hedeselskabet 2 O og overføres til en glasflaske og autoklaver. Opbevares ved 4 ° C.
  6. 5 M NaCl: I bægerglas afvejes 58,4 g NaCI (BioShop Canada) og opløs i 150 ml af Ddh 2 O. Juster volumen til 200 ml med Hedeselskabet 2 O. Opløsningen overføres til en glasflaske, autoklav og opbevar ved 4 ° C.
  7. DNA elueringspuffer: I et bægerglas, blandes 2 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8 ml 5 M NaCI og 0,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). Juster volumen til 200 ml med Hedeselskabet 2 O. Autoklave og opbevares ved 4 ° C.
  8. 2 x reaktionsbuffer (2 x RB, 100 mM HEPES, 300 mM NaCI, 30 mM MgCl2): Til en 50 mL Falcon rør (BD Falcon), tilsættes 1,2 g HEPES (BioShop Canada), 0,88 g NaCl og 0,30 g MgCl2 • 6H H2O (EMD Chemicals) og 30 ml af Hedeselskabets 2 O. Bland ved at ryste mildt, indtil komponenterne er fuldstændig opløst. PH indstilles til 7,5 ved tilsætning af 10 N NaOH-opløsning og indstille slutrumfanget til 50 ml med ddh 2 O. Oprense opløsning ved anvendelse af en sprøjte-drevet filterenhed (0,22 um, Millipore) og opbevares ved 4 ° C.
  9. Luria Bertani (LB) bouillon: I et bægerglas, afvejes 20,0 g LB-pulver (Sigma-Aldrich) efterfulgt af tilsætning af en L af Ddh 2 O. Blandes grundigt opløsning med en magnetisk omrørerstav, opløsningen overføres til en konisk kolbe. Autoklaverer opløsningen og opbevar ved stuetemperatur.
  10. 1,5% LB agar: Afvej 1,5 g agar (BioShop Canada) i en 250 ml kolbe, og der tilsættes 100 ml flydende LB. Autoklaven blandingen og opbevar ved stuetemperatur.
  11. Agar plating: Melt LB agar i en mikrobølgeovn og opløsningen afkøles til -50 ° C. Hældes opløsningen i petriskåle (Fisher Scientific) under en flamme. Det er vores erfaring, kan 100 ml LB-agar give 5-6 plader.

2. Konstruktion af RFD-EC1 og RFSS1 af Skabelon medieret Enzymatisk Ligation

RFD-EC1 (fig. 2A) er udstyret DNAzyme. Det består af det katalytiske sekvens EC1 og substratet sekvensen FS1 (angivet ved sorte og grønne linier i fig. 2A). RFSS1 (fig. 2A) er en kodet version af RFD-EC1, hvor det katalytiske sekvens EC1 er delvist blandes ind SS1 men FS1 del forbliver uændret. RFD-EC1 og RFSS1 blev fremstillet ved template-medieret enzymatisk ligering af oligonucleotidet FS1 med oligonukleotid EC1 eller SS1 i nærvær af LT1 som ligering skabelon (se indsat boksen i fig. 2A). Fremgangsmåden til udførelse af ligeringsreaktionen er tilvejebragt nedenfor.FS1 blev opnået fra Keck Oligo Syntese faciliteter på Yale University, afbeskyttet og oprenset ved gelelektroforese efter en tidligere etableret protokol. 17-24 EC1, SS1 og LT1 blev indkøbt fra Integrated DNA Technologies og oprenset ved gelelektroforese.

  1. Forbered en 100 uM stamopløsning af FS1, EC1, SS1 og LT1 hjælp DdH 2 O. Opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse.
  2. Overfør 5 pi af FS1 stamopløsning to 1,5 gl mikrocentrifugerør markeret som røret 1 og Tube 2. Til hvert rør, 38,5 pi ddH2O og derefter 5 pi 10 x T4 polynukleotidkinase (PNK) reaktionsbuffer tilsættes A (MBI Fermentas), som indeholder 500 mM Tris-HCI (pH 7,6, 25 ° C), 100 mM MgCl2, 50 mM DTT, 1,0 mM spermidin. Bland hver opløsning ved pipettering (pipette løsningen op og ned et par gange).
  3. Tilsættes 1 ml af ATP (100 mM; MBI Fermentas) og blandes ved pipettering.
  4. Tilsæt 0,5 ul af T4-polynukleotidkinase (PNK, 10 enheder / ul; MBI Fermentas) og blandes ved pipettering. Inkubér reaktionsblandingerne ved 37 ° C i 30 min. Sørg for at dække rørene med aluminiumfolie for at minimere fotoblegning af fluoroforen.
  5. Stands reaktionen ved opvarmning til 90 ° C i 5 min. Reaktionsblandingen afkøles blandingerne ved stuetemperatur i 10 minutter.
  6. Tilsættes 5 pi af EC1 og SS1 stamopløsning på røret 1 og røret 2, henholdsvis.
  7. Tilsættes 5 pi af LT1 stamopløsning til hvert rør, blandes ved pipettering. Opvarme reaktionsblandingerne ved 90 ° C i 1 minut og afkøles til stuetemperatur i 10 min.
  8. Tilsættes 118 pi ddH2O og derefter 20 pi 10 x T4 DNA-ligase-puffer (MBI Fermentas), som indeholder 400 mM Tris-HCI (pH 7,8 ved 25 ° C), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT og 5 mM ATP. Bland opløsningen ved pipettering.
  9. Tilsættes 2 ul T4 DNA ligase (5 enheder / ul, MBI Fermentas) og blandes ved pipettering. Inkubér reaktionsblandingerne ved stuetemperatur i 1 time.
  10. Tilsættes 20 pi 3 M NaOAc (pH 7,0) til hvert rør, vortex og vågeblus. Tilsæt 500 pi 100% kold ethanol til hvert rør, blande opløsningen ved hvirvelblanding og placere rørene i -20 ° C fryser i 30 minutter.
  11. Centrifugeres blandingerne ved 11.000 g i 20 minutter ved 4 ° C i en kølecentrifuge (Allegra X22-R, Beckman Coulter) og fjern supernatanten ved pipettering.
  12. Tør DNA-pelleten med en DNA-koncentrator (Savant DNA Speedvac, Thermo Scientific) i 10 minutter.
  13. Resuspender DNA pellets i 30 pi 1 × gel loading-buffer (GLB), kort vortex og dreje ned med en bordcentrifuge (Minicentrifuge, VWR Scientific). Det ligerede DNA prøver er klar til læsning på en 10% dPAGE gel.

3. Fremstillinq af 10% dPAGE Gel

De følgende trin beskriver kort apparatet gelelektroforese og set-up. For nærmere detaljer om de apparater, indstillinger og håndtering, henvises to vores tidligere publicerede protokoller. 30,31

  1. Vaske og tørre to glasplader, to 0,75 mm-afstandsstykker og en 16-brønds kam. Saml glasplader og afstandsstykker med clips og lå vandret på en flad overflade med notched glasplade opad.
  2. Overføre 40 ml 10% dPAGE blanding i et 150 ml bægerglas. Tilsæt 40 ​​ul af tetramethylethylendiamin (TEMED; Bioshop Canada), 400 pi 10% APS, og bland ved omrystning med en pipette.
  3. Hæld blandingen forsigtigt mellem pladerne og straks indsætte kammen. Tillade blandingen at polymerisere i 10 til 20 minutter. Polymerisation kan bekræftes ved at kontrollere den resterende gel blandingen efterladt i bægerglasset.
  4. Når først polymeriseres fjernes kammen forsigtigt og skyl brøndene med ddH2O til fjernelse af resterende gelopløsning i brøndene.
  5. Monteres pladerne på gelelektroforese apparatet med uden kærv rektangulær plade udad og sætte en metalplade bag indhak forsynede plade. Anvendelsen af ​​metallet plspiste hjælper med at forhindre overophedning, der kan revne glaspladerne.
  6. Tilsættes 1 × TBE til de øvre og nedre kamre i apparatet. Tjek for at sikre, at brøndene fyldes med pufferen og den nedre kant af gelen er nedsænket i bufferen.
  7. Anvend en 40 mA (eller 750 V), nuværende og Pre-Kørsel i 10 til 15 min.

4. Oprensning af Ligeret RFD-EC1 og RFSS1 med 10% dPAGE Gel

  1. Efter trinnet til 3,7, brønde vaskes med 1 x TBE ved hjælp af en sprøjte og en nål.
  2. Indlæse ligeringsblandingen af ​​RFD-EC1 og af RFSS1 (fra 2,13) ​​i 2 brønde (én for hver) under anvendelse af en pipette og gelpåsætning spidser (Diamed). Anvende en 40 mA (750 V) strøm, indtil det nederste farvestof (bromphenolblåt) er cirka 5 cm over den nedre kant af pladerne.
  3. Fjern glasplader fra gelen kørende apparat, ligge ned på en flad bænk og forsigtigt fjerne afstandsstykker.
  4. Forsigtigt fjerne det øverste glaspladerne fra gelen ogindpakke gelen med plastfolie (prøve at undgå rynker og foldning af vindinger på gelen).
  5. De ligerede produkter kan visualiseres enten ved UV-skygning (260 nm) eller ved gennemlysning (360 nm), hvilket vil frembringe en synlig DNA-bånd nogle få centimeter over EC1 eller SS1 (100 pmol af EC1 eller SS1 kan anvendes som en markør og fyldes i en brønd i trin 4.2). Marker de ønskede DNA-bånd med en markør.
  6. Udskære DNA-bånd med sterile barberblade, skæres gelen i små stykker og overførsel til et frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  7. Knuse gelstykker i mikrocentrifugerør ved hjælp af en steril pipettespids (200 uL dysestørrelse).
  8. Tilsæt 500 pi DNA elueringspuffer til hvert rør og dække dem med aluminiumsfolie for at beskytte fluoroforer mod lys. Vortex prøverne i 10 min.
  9. Centrifugeres prøverne ved 11.000 g i 4 minutter ved 4 ° C i en kølecentrifuge (Allegra X22-R, Beckman Coulter) og forsigtigt overføre 350 pi supernatant til et frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør (hvis det er nødvendigt, kan en anden eluering udføres med 350 pi frisk elueringsbuffer i yderligere 10 min).
  10. Tilsættes 35 uL (0,1 x af prøvevolumenet) af 3 M natriumacetat (NaOAc, pH 7,0) til hvert rør, blandes ved omhvirvling og spin ned. Tilsættes 900 pi 100% kold ethanol til hvert rør. Hver prøve blandes i hand-shaking røret i nogle få sekunder. Anbringe rørene ved -20 ° C i mindst 1 time.
  11. Centrifugeres prøverne ved 11.000 g i 20 minutter ved 4 ° C i en kølecentrifuge og fjern supernatanten ved pipettering.
  12. Tilsæt 100 pi kold 70% ethanol og bruge det til forsigtigt skylle hele den indre væg af røret. Re-centrifuge ved 11.000 g i 7 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og tørring af bundfaldet ved hjælp af DNA koncentrator i 10 min.
  13. Opløse DNA pellets i 100 pi ddH2O og vortex. Bestemmelse af DNA-koncentration baseret på UV-absorbans ved 260 nm. Opbevar prøverne ved -20° C indtil anvendelse.

5. Fremstillinq af bakterier

  1. Målet bakteriestamme E. coli K12 (MG1655) og relevante kontrolstammer første udpladet på LB-agarplader fra glycerol lagre. Under en flamme eller inden for en biologisk sikkerhed kabinet, røre ved bakterielle glycerol bestanden med en steril pipette spids og forsigtigt stryges på pladens overflade for at undgå at beskadige LB agar.
  2. Invertsukker udstrøgne plader og inkuberes ved 37 ° C i 14 timer. Efter inkubation forsegle hele omkredsen af ​​pladerne med parafilm (Pechiney plastemballage) og opbevares ved 4 ° C. Disse plader kan lagres i op til 4 uger.

6. Fremstilling af rå Ekstracellulære blandinger (CEMS)

  1. Dispensere 2 ml LB i sterile 14 ml kultur rør (BD Falcon) med en pipette pistol (Corning).
  2. Med en steril pipette spids, vælge en enkelt koloni fra en agarplade forberedt i trin på 5,2 og sæt det i acULTUR rør. Rørene anbringes i en inkubator (New Brunswick Scientific) ved 37 ° C, og rystes ved 250 rpm i 14 timer.
  3. 1% re-inokulation kultur: Dispenser 2 ml frisk LB i 14 ml kultur rør og piggen med 20 ul af bakterielle kulturer fremstillet i trin 6.2. Inkuber rørene ved 37 ° C med rystning ved 250 rpm, indtil hver bakteriel opløsning når en OD600 (optisk densitet målt ved 600 nm) på cirka 1. At måle OD600, overføre 1 ml af hver kultur til en engangskuvette og mål absorbansen ved 600 nm med en UV-spektrofotometer (Genesys UV 10, Thermo Scientific).
  4. Overfør 1 ml af hver kultur til en ny 1,5 ml mikrocentrifugerør og pelletere cellerne ved centrifugering ved 11.000 g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Overfør den klare supernatant til et frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C, hvis den ikke anvendes straks.

7. Detektion ved hjælp af fluorescens-spektrofotometer

  1. Tænd fluorescensspektrofotometer (Cary Eclipse, Varian Inc.) og oprette dataopsamlingssystemer parametre med excitation ved 488 nm og emission ved 520 nm. Aflæsninger kan tages hvert minut i 1 time.
  2. Vask 3 kvartskrystal kuvetter (Varian Cary) med ddH2O, efterfulgt af 100% ethanol. Tørre kuvetterne ved at blinke nitrogengas. Etiket kuvetter C1 (kontrol 1), C2 (kontrol 2) og T (test).
  3. Overførsel 24 uL af Hedeselskabets 2 O til C1 og 24 pi CEM-EF til C2 og T. Tilsæt 25 ul af 2 × RB til hver kuvette og placere dem i fluorescens spektrofotometer. Start indsamle fluorescens data for de første 5 min.
  4. Tilsættes 1 ml af RFSS1 (fra en 5 uM stamopløsning) til C2 og en pi RFD-EC1 (fra en 5 uM stamopløsning) til T og C1. Bland hver opløsning ved pipettering. Dette skal omhyggeligt initieres således at fluorescens målinger ikke afbrydes. Tillade reaktionen at fortsætte i resten af ​​1 h. opsamlingstid.
  5. Gemdata i Excel-filformat, overføre data til en personlig computer og bearbejde data til at skabe et grafisk billede.

8. Detektion ved gelelektroforese

De samme reaktionsblandinger fremstillet i trin 7,4 kan anvendes til analyse ved gelelektroforese; alternativt nye reaktioner kan fremstilles på lignende måde og inkuberet i 1,5 ml mikrocentrifugerør. I begge tilfælde:

  1. Dæmpning reaktioner (efter 1 h) ved tilsætning af 5 pi 3 M NaOAc og 125 pi 100% ethanol. Blandes hver opløsning ved hvirvelblanding og placere rørene i -20 ° C fryser i 1 time.
  2. Centrifuger reaktionsblandingerne ved 11.000 g i 20 minutter ved 4 ° C og omhyggeligt fjernes supernatanten ved pipettering.
  3. Tørre pellets ved hjælp af DNA koncentrator i 10 min.
  4. Resuspender pellets i 20 pi 1 × GLB ved kortvarigt hvirvelbehandlet. Spinnes ned rør meget kort med en bordcentrifuge (Minicentrifuge, VWR Scientific). Disse prøver læsesy til fyldning i en dPAGE gel.
  5. Fremstilling af en 10% dPAGE gel som beskrevet i 3,1-3,7. Læg reaktion prøver (fra trin 8,4) i brøndene ved hjælp af en pipette og gelpåsætning tips (Diamed). Anvende en 40 mA (750 V) strøm, indtil det nederste farvestof (bromphenolblåt) er cirka 5 cm over den nedre kant af pladerne.
  6. Fjerne glasplader og vaskes grundigt med ledningsvand for at fjerne eventuelle gelstykker. Tør plader med en Kimwipe (Kimberly-Clark Professional).
  7. Scan gelpladen for fluorescens ved hjælp af en tyfon Scanner (Typhoon 9200, Variable mode, GE Healthcare). Analyser af data ved hjælp af ImageQuant software (Molecular Dynamics).

9. Detection Specificitet

  1. For at teste bakteriel specificitet, beskrev de samme procedurer ovenfor for dyrkning E. coli, kan udarbejde sin CEM og gennemføre en spaltningsreaktion assay udføres for et antal forskellige bakteriestammer, såsom B. subtilis, P. Peli, Y. ruckeri, L. planturum, P. acidilactici (vist i fig. 3A).

10. Single Cell Detection

Forbered en 1 ml E. coli glycerol lager af 2 CFU / ml (CFU: kolonidannende enhed) ved seriefortynding og bekræfte CFU koncentration ved udpladning 5. Dette lager bør indeholde 0,2 cfu/100 uL.. Opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse.

  1. Forberede 10 dyrkningsrør indeholdende 2 ml LB.
  2. Inokulere hver kultur med 100 pi 2 CFU / ml glycerol lager og inkuber ved 37 ° C med rystning ved 250 rpm. Anvendelsen af ​​hele glycerollage (1 ml) bør give 10 kulturer.
  3. Høst 300 uL af hver podet kulturen rør ved de følgende tidspunkter: 4, 8, 12, 16 og 24 timer. Forlader den resterende kultur til at vokse i 24 timer.
  4. Måle OD600 og udfælde cellerne ved centrifugering ved 11.000 g i 5 min.
  5. Overfør CEMS til friske 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 & df. eks C indtil anvendelse.
    Bemærk: Da der måske ikke detekterbar OD600 for prøver høstet på tidspunkter 4, 8 og 12, tillader den resterende kultur til at vokse i 24 timer for at identificere kulturer indeholdende bakterier (bestemt ved turbiditet og OD-måling). Kun en eller to af de 10 kulturerne kan indeholde E. coli efter inokulering og de ​​resterende rør vil ikke indeholde nogen celler.
  6. Brug CEMS inddrives fra positive kulturer (opbevaret ved -20 ° C) på de udpegede tidspunkter til at forberede spaltningsreaktionerne med RFD-EC1, og derefter analysere reaktionsblandingerne med dPAGE gelelektroforese som beskrevet i afsnit 8.

11. Koncept og repræsentant resultater

Begrebet udnytte en RNA-spaltning fluorescerende DNAzyme (RFD) for bakteriel detektion er illustreret i fig. 1. RFD spalter et kimært DNA / RNA-substrat ved et enligt RNA binding (blue R) flankeret af to mærkede nukleotidermed en fluorofor (F) og en quencher (Q), hhv. En bakterie af interesse (såsom E. coli) vokser i mediet, vil det efterlade en rå ekstracellulært blanding (CEM). Dette CEM som helhed anvendes derpå i en in vitro-selektion eksperiment for at opnå en RFD, som reagerer specifikt til CEM, formodentlig RFD interagerer med et specifikt molekyle (lilla stjerne) i CEM, som er en signatur molekyle af bakterien. Når CEM sættes til reaktionsopløsningen indeholdende RFD, udløser den RNA-spaltning aktivitet RFD. Spaltningen arrangement adskiller F fra Q, hvilket resulterer i et fluorescerende signal, der kan detekteres enten ved hjælp af et fluorimeter eller ved gelelektroforese.

Den eksperimentelle validering af ovenstående koncept blev udført med CEM fra E. coli (CEM-EF). Vi fik 3 RfD molekyler via in vitro-selektion, og den mest effektive en blev udpeget som RFD-EC1 (Fig. 2A). 5 We testet spaltning aktivitet RFD-EC1 (sammen med en mutant sekvens navngivet RFSS1) som respons på CEM-EC. Både RFD-EC1 og RFSS1 blev fremstillet ved enzymatisk ligering af DNAzyme dele til substratet FS1 (alle sekvenser er vist i fig. 2A). I fluorescensmåling eksperimentet (fig. 2B), blev CEM-EC inkuberet alene i 5 minutter, efterfulgt af tilsætning af RFD-EC1 eller RFSS1, og ved yderligere inkubation i 55 mere min. Fluorescensintensiteten af ​​opløsningen blev kontinuerligt læst hvert minut, og dataene blev anvendt til at beregne relative fluorescens (RF; beregnet som forholdet mellem fluorescensintensiteten ved tiden t i forhold til fluorescensintensitet ved tid 0). RF-værdier versus inkubationstiden er afbildet som fig. 2B. Det blev fundet, at RFD-EC1 fremstillet af et højt fluorescens-signalet ved tilsætning af CEM-EC; i skarp kontrast havde RFSS1 ikke frembringe en stærk fluorescens-signal. Således fluorescens-producerende function af RFD-EC1 ved kontakt CEM-EF er sekvens-specifik.

For at verificere, at de observerede fluorescens forøges skyldes spaltning af RNA-binding analyserede vi reaktionsblandinger ved dPAGE. Spaltning af RFD-EC1 forventes at generere to DNA-fragmenter, et 5 'fragment bevare fluorofor og en 3'-fragment bevarer quencher. Kun uspaltede RFD-EC1 (unclv) og 5'-fragment (CLV) kunne detekteres ved fluorescens billeddannelse. Den dPAGE Resultatet er vist i fig. 2C viser, at reaktionsblandingen i RFD-EC1 og CEM-EF faktisk producerede det forventede spaltningsprodukt, medens RFSS1/CEM-EC blandingen ikke gjorde.

Specificiteten af RFD-EC1 blev undersøgt under anvendelse CEMS indsamlet fra flere andre gramnegative og grampositive bakterier, og dataene er vist i fig. 3A. Kun prøven indeholdende CEM-EC (blå kurve) frembragte en stigning i fluorescens. Den manglende kryds-reaktivitet med CEMSfra de andre bakterier, indikerer, at RFD-EC1 er yderst selektiv for E. coli.

Vi undersøgte også den nødvendige tid til dyrkning af en enkelt E. coli-celle for at frembringe tilstrækkelig CEM, som kan inducere spaltningen af RFD-EC1. Til dette eksperiment blev en E. coli prøve indeholdende defineret CFU (kolonidannende enheder) blev tilstrækkeligt fortyndet for at opnå en koncentration på 1 CFU / mL. Dette blev efterfulgt af blanding af 100 pi af fortyndet bakterieprøven med vækstmedier og dyrke dem til 4, 8, 12, 16 og 24 timer. CEMS blev derefter opsamlet for hvert tidspunkt og testet for at inducere spaltning aktivitet RFD-EC1. Den dPAGE Resultatet er vist i fig. 3B viser, at en dyrkningstid på 12 timer er nødvendig.

Det er vigtigt at bemærke, at den første lille signal stigning i fluorescens målinger efter tilsætning af RFSS1 sekvens (som en negativ kontrol) til CEM-EC (fig. 2B; rød curve) eller RFD-EC1 til andre bakterielle CEMS (fig. 3B; alle kurver bortset blå) tilskrives den iboende fluorescens FRQ modulet (på grund af ufuldstændig quenching af F ved Q). Således forventes det, at tilsætningen af ​​F-og Q-mærkede sekvenser ville frembringe en initial fluorescens stigning. Imidlertid kun RFD-EC1/CEM-EC blandinger er i stand til at frembringe et højt niveau af fluorescens over tid.

Figur 1
Figur 1. Skematisk illustration af RNA-spaltende fluorescerende DNAzyme (RFD) probe, der fluorescerer ved kontakt med den rå ekstracellulære blanding (CEM) fremstillet af specifikke bakterielle celler af interesse. RFD spalter et kimært DNA / RNA-substrat ved et enligt RNA binding (blue R) flankeret af to nukleotider mærkes med en fluorofor (F) og en quencher (Q), hhv. Før spaltningsreaktionen er fluorescens niveau RFD minimal på grund af den tætte proximity af F og Q. Ved spaltning, Q afviger fra F, som et resultat, er et stærkt fluorescerende signal, der frembringes.

Figur 2
Figur 2. E. coli-sensing RFD. (A) RFD-EC1 er DNAzyme probe, som kan aktiveres af CEM-EC. RFSS1 er kodet sekvens af RFD-EC1 anvendt som en kontrol. RFD-EC1 og RFSS1 blev fremstillet ved ligering af FS1 med EC1 og SS1, henholdsvis, i nærvær af LT1 som template. F: fluorescein-modificeret deoxythymidin. Q: Dabcyl-modificeret deoxythymidin. R: adenin ribonukleotid. (B) Fluorescence signalering profiler af RFD-EC1 og RFSS1 i nærvær af CEM-EC. (C) dPAGE analyse af spaltningsprodukterne reaktionsblandingerne i B (reaktionstid: 60 minutter). Billedet er en fluorescens billede af dPAGE gelen opnået med den Typhoon scanner. Bane NC: RFD-EC1 eller RFSS1 i reaktionen puffer alene, bane CEM-EF: RFD-EC1 eller RFSS1 i reaktionspuffer indeholdende CEM-EC. Marker: RFD-CE1 behandles med 0,25 N NaOH, en fremgangsmåde kendt for at forårsage fuldstændig spaltning af RNA. unclv: uspaltede RFD-EC1. CLV: spaltningen fragment indeholdende fluorophor.

Figur 3
Figur 3 (a) Fluorescence signalering profil af RFD-EC1 i CEMS fremstillet ud fra forskellige bakterielle celler. EF: Escherichia coli-K12, PP: Pseudomonas PELI; BD: Brevundimonas diminuta, HA: Hafnia alvei; YR: Yersinia ruckeri; OL: Ochrobactrum grignonese; AX: Achromobacter xylosoxidans, MO: Moraxella osloensis, AI: Acinetobacter lwoffi; SF: Serratia fonticola, BS: Bacillus subtilis; LM: Leuconostoc mesenteroides, LP: Lactobacillus planturum; PA: Pediococcus acidilactici; AO: Actinomyces orientalis. Hver CEM prøve blev inkuberet i 5 min efterfulgt af tilsætning af RFD-EC1. (B) dPAGEAnalysen af ​​RFD-EC1/CEM-EC blandinger efter 60 minutters reaktion. Bane NC1: RFD-EC1 i reaktionen puffer alene. Bane NC2: RFD-EC1 i reaktionspuffer indeholdende CEM-BS (CEM fremstillet ud fra Bacillus subtilis). Banerne mærket med 4, 8, 12, 16 og 24: RFD-EC1 i reaktionspuffer indeholdende CEM-EF taget fra det bakterielle kultur indeholdende en enkelt E. coli-celle efter en dyrkningsperiode på 4, 8, 12, 16 og 24 timer hhv.

Discussion

De fleste af de almindelige bakterielle detektionsmetoder dag er enten langsom (klassisk mikrobiel) eller teknisk krævende (antistof PCR). Derfor mener vi, at den næste generation af værktøjer til afsløring, bør tage højde mod hastighed og enkelthed. Til dette formål har vi skabt en RNA-spaltende og fluorescens-signalering DNAzyme, der kan bruges til at udvikle simple analyser til at rapportere tilstedeværelsen af ​​bakterier ved produktion af en fluorescens signal. Den udstyret DNAzyme probe, RFD-EC1, der aktiveres af CEM fremstillet under væksten af E. coli i kulturmedier. Da vores metode bruger rå ekstracellulære blandinger af en bakterie som mål for afsløring og omgår den besværlige målet udvinding og amplifikationstrinnene, kan det bruges til at oprette meget enkel, "mix-og-læse" type af analyser til påvisning af bakterier. Anvendelse af vores DNAzyme er ikke begrænset til fluorescens-baseret detektionsmetode. For eksempel ved anvendelse kolorimetrisk påvisning af samme DNAzyme systemet assay cen udformes ved hjælp af en tidligere beskrevet metode, der udnytter rullende cirkel amplifikation i forbindelse med et organisk farvestof. 32 Vi forudser anvendelse af DNAzymes for bakteriel detektion som en attraktiv vej til at generere nye bakterielle biosensorer med større operationel enkelhed.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Finansieringen af ​​dette arbejde blev leveret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) og Sentinel Bioactive Paper Network.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada AGR003
Ammonium persulfate (APS) BioShop Canada AMP001
Acrylamide/Bis-acrylamide (40%, 29:1) BioShop Canada ACR004
Boric acid BioShop Canada BOR001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
EDTA Electron Microscopy Sciences EXO539-1
HCl Sigma-Aldrich 38281
HEPES BioShop Canada HEP001
LB broth Sigma-Aldrich L3022
MgCl2 EMD Millipore B10149-34
NaCl BioShop Canada SOD002
NaOAc EMD Millipore SXO255-1
NaOH EMD Millipore SXO590-1
SDS BioShop Canada SDS001
TEMED BioShop Canada TEM001
Tris-base BioShop Canada BST666
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Urea BioShop Canada URE001
Xylenecyanol FF Sigma-Aldrich X4126
DNA concentrator Thermo Fisher Scientific, Inc. Savant DNA SpeedVac 120
Millex filter unit EMD Millipore SLGP033RS
Gel loading tips Diamed TEC200EX-K
ImageQuant software Molecular Dynamics Version 5.0
Kimwipes Kimberly-Clark Corporation 34705
Mini Vortexer VWR international 58816-121
Parafilm Pechiney Plastic Packaging PM996
Petri dishes Fisher Scientific Fisherbrand 08-757-12
Stripettor Plus (Pipette gun) Corning 07764714
Quartz cuvettes Varian Inc., Agilent 66-100216-00
Shaker/Incubator New Brunswick Scientific Classic Series C24
Typhoon Scanner GE Healthcare 9200 Variable mode
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X22-R
UV Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc. GenesysUV 10
Fluorescence Spectrophotometer Varian Inc., Agilent Cary Eclipse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Zourob, M., Elwary, S., Truner, A. Springer. New York. (2008).
  2. Call, D. R. Challenges and Opportunities for Pathogen Detection Using DNA Microarrays. Crit. Rev. Microbiol. 31, 91-99 (2005).
  3. Lazcka, O., Campo, D. el, J, F., Muñoz, F. X. Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors. Biosens. Bioelectron. 22, 1205-1217 (2007).
  4. Velusamy, V. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28, 232-254 (2010).
  5. Ali, M. M. Fluorogenic DNAzyme Probes as Bacterial Indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
  6. Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
  7. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional Nucleic Acid Sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
  8. Li, Y., Lu, Y. Functional Nucleic Acids for Analytical Applications. Springer. New York. (2009).
  9. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  10. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  11. Joyce, G. F. Forty Years of In Vitro Evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6420-6436 (2007).
  12. Breaker, R. R., Joyce, G. F. A DNA enzyme that cleaves RNA. Chem. Biol. 1, 223-229 (1994).
  13. Cuenoud, B., Szostak, J. W. A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity. Nature. 375, 611-614 (1995).
  14. Chinnapen, D. J., Sen, D. A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 65-69 (2004).
  15. Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
  16. Silverman, S. K. DNA as a versatile chemical component for catalysis, encoding, and stereocontrol. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 7180-7201 (2010).
  17. Mei, S. H. An efficient RNA-cleaving DNA enzyme that synchronizes catalysis with fluorescence signaling. J. Am. Chem. Soc. 125, 412-420 (2003).
  18. Liu, Z. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal-ion specificities and pH dependences. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
  19. Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme. Nucleic Acids Res. 33, 7164-7175 (2005).
  20. Rupcich, N. Quenching of fluorophore-labeled DNA oligonucleotides by divalent metal ions: implications for selection, design, and applications of signaling aptamers and signaling deoxyribozymes. J. Am. Chem. Soc. 128, 780-790 (2005).
  21. Shen, Y., Brennan, J. D., Li, Y. Characterizing the secondary structure and identifying functionally essential nucleotides of pH6DZ1, a fluorescence-signaling and RNA-cleaving deoxyribozyme. Biochemistry. 44, 12066-12076 (2005).
  22. Chiuman, W., Li, Y. Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores. J. Mol. Biol. 357, 748-754 (2006).
  23. Chiuman, W., Li, Y. Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction. Chem. Biol. 13, 1061-1069 (2006).
  24. Shen, Y. Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure. Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).
  25. Ali, M. M., Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3. Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).
  26. Chiuman, W., Li, Y. Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates. Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).
  27. Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design. PLoS ONE. 2, e1224 (2007).
  28. Shen, Y. Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing. Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).
  29. Kandadai, S. A. Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5. Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).
  30. Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification. Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).
  31. Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications. Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).
  32. Ali, M. M., Li, Y. Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).
Påvisning af bakterier under anvendelse Fluorogene DNAzymes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961, doi:10.3791/3961 (2012).More

Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961, doi:10.3791/3961 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter