Esquema 1. Auto-montagem de BTA baseados discotics em tampão de citrato em agregados esféricos mostrando diâmetros de cerca de 5 nm, em concentrações milimolares de bloco de construção. O aumento da força iónica pela adição de NaCl resultados na formação de hastes alongadas, com um diâmetro de cerca de 3 nm e comprimento de menos de 25 nm. para ver figura maior . 1. Preparando um BTA-Gd (III) DTPA Soluções para CD Espectroscopia e medição da temperatura-dependente Spectra CD como uma função da concentração de NaCl Preparar um tampão de citrato 100 mM (pH 6,0). Preparar um tampão de citrato 100 mM (pH 6,0) com 2 M de NaCl. Dissolve-se 0,254 mg de BTA-Gd (III) DTPA (MW = 3184 g • mol -1) em 10 mL de tampão de citrato 100 mM, target concentração 8 • 10 mM -3 de BTA-Gd (III) DTPA. Sonicar a solução durante 5 minutos. Encher uma cuvete 1 centímetro de UV com a solução e medir um espectro de CD a partir de 230 a 350 nm e uma curva de arrefecimento CD na maior banda intensidade CD (por exemplo, lambda = 269 nm) 363-283 K, a uma taxa de 1 K min – 1. Adicionar o mesmo volume de 2 M de NaCl tamponado solução para o citrato de solução tamponada de TBA-Gd (III) DTPA, a fim de aumentar a força iónica para 1 M de NaCl, diluindo as discotics a metade da concentração, a concentração alvo 4 • 10 -3 mM de TBA-Gd (III) DTPA. Vortex da solução com o aumento da força iônica por 5 minutos. Remensurar um espectro de CD a partir de 230 a 350 nm e uma curva de arrefecimento CD na maior banda intensidade CD 363-283 K, a uma taxa de 1 K min -1. 2. Ajuste dos dados T-dependentes de CD para um modelo para T-dependement Auto-montagem Os dados do CD-primas foram exportados para Origin 8.5 e normalizado. Isto foi conseguido através da definição de o efeito de CD na maior temperatura medida como igual a 0, eo efeito de CD no nível mais baixo de temperatura medida como igual a 1. Uma vez que a magnitude do CD-efeito é proporcional ao grau de agregação 8, as curvas normalizadas CD-se proporcional ao grau de agregação. Os dados normalizados foram ajustados usando a opção de ajuste não-linear da curva em OriginPro 8.5 usando um T-dependente modelo de auto-montagem obtidos por van der Schoot 8,9. Neste modelo, uma nucleação e um regime de alongamento são distinguidos. Primeiro, o grau de agregação do regime de alongamento (T <T e) foi montado, usando a seguinte equação: Equação acima contém (próximo da temperatura variável, T, eo grau de AGGRegation e Φ n) Três parâmetros; isto é, a entalpia de alongamento e h, o alongamento temperatura T e (a temperatura a que a auto-montagem é iniciado) eo parâmetro Φ SAT, o qual é introduzido para assegurar que Φ n / Φ sab faz não pode exceder a unidade, o que resulta a restrição de que o grau de agregação não pode exceder a unidade. Encaixe torna a entalpia de alongamento h e (J / mol) e o alongamento temperatura T e (K) que caracterizam a auto-montagem das moléculas de uma dada concentração. Na montagem, uma restrição que deve ser obedecido é que apenas o grau de agregação em temperaturas abaixo de T e devem ser instalados, uma vez que a equação 2.1 é válida apenas no regime de alongamento. Em seguida, o grau de agregação experimentalmente encontrados noregime de nucleação pode ser equipado, usando a seguinte equação: Acima equação contém (ao lado das variáveis T e Φ n) quatro parâmetros dos quais já foram determinadas três com a equação 2,1; isto é, a entalpia de alongamento e h, o alongamento temperatura T e eo Φ parâmetro SAT. O único parâmetro desconhecido é o K um valor que descreve a cooperatividade da nucleação de fase que é encontrado pelo ajuste do grau de agregação experimentalmente encontrados para temperaturas acima de T e. 3. Preparando BTA-GD Solutions (III) DTPA para Microscopia Eletrônica de Transmissão e Visualização de Polímeros Supramoleculares via criogênico TEM Preparar dois tampões: um tampão de citrato 100 mM (pH 6,0) e um tampão de citrato 100 mM (pH 6,0) wom 5 M de NaCl. Dissolve-se 0,318 mg de BTA-Gd (III) DTPA (MW = 3184 g • mol -1) em 0,1 mL de cada um dos tampões, preparados, alvo concentração de 1 mM de TBA-Gd (III) DTPA. A vitrificação amostra para criogénico MET é realizada utilizando um robot de vitrificação automatizado (FEI Vitrobot Mark III). CryoTEM grades (R2 / 2 Quantifoil Jena grelhas de Quantifoil Micro Tools GmbH) são plasma superfície tratada antes do procedimento de vitrificação utilizando um Cressington 208 operacional revestidor de carbono a 5 mA durante 40 s. A solução aquosa é então aplicada sobre a grelha durante vitrificação em um automatizado FEI Vitrobot. Isto envolve a aplicação da amostra sobre a grade, blotting de líquido em excesso para criar uma película fina da solução aquosa na grelha e vitrificação subsequente por meio de imersão a grade muito rapidamente no etano líquido. Depois de vitrificação a amostra é mantida em azoto líquido e transferidas manualmente na cassete autoloader, também cooled com azoto líquido. A cassete é então inserido no carregador automático do MET. Tudo isso é feito manualmente. Os experimentos são realizados cryoTEM na TU / e cryoTitan (FEI), ( www.cryotem.nl ). O cryoTitan TU / e está equipado com uma pistola de emissão de campo operacional (FEG) a 300 kV. As imagens foram gravadas usando um 2k x 2k Gatan câmera CCD equipado com um pós-coluna Gatan Energia Filter (GIF). 4. 1 H-DOSY As medições de RMN de esférico de auto-montagem BTA-Gd (III) DTPA em baixa força iónica Prepara-se uma 50 mM de tampão d 6-succinato em D 2 O («pH 6,0 '); o buffer é preparada por dissolução de ácido 6-d succínico em D 2 O, seguido por ajustamento do pH para 6,0 usando 1 M ND 4 OD em D 2 O. A concentração final de 50 mM de succinato foi ajustado com adicional D 2 O. Uma vez que Gd (III) é altamente paramagnéticoe sinais de 1 H seria assim aumentado significativamente, Gd (III) foi substituído por Y (III). Dissolve-se 2,98 mg de TBA-Y (III) DTPA (MW = 2979 g • mol -1) em 1 mL de um tampão de 50 mM d 6-succinato em D 2 O («pH 6,0 '), a concentração-alvo 1 mM BTA- Y (III) DTPA. As medições de 1 H-RMN DOSY são realizadas em um Varian Unity Inova 500 equipado com um espectrómetro de 5 mm ID PFG-sonda da Varian. Os experimentos DOSY foram realizados utilizando o DOSY one-shot (Doneshot, Varian) seqüência de pulsos. Os 90 graus vezes und pulso de mistura foram adaptados em conformidade. Os desvios químicos foram referenciados usando o desvio químico da 3 – (trimetilsilil)-propiónico-2, 2,3,3 – [D 4] sal de sódio de ácido (TMSP). A auto-difusão de HDO foi utilizado para calibrar as medições, que é conhecido da literatura que a auto-difusão de HDO em D 2 O a 298 K é 19,0 m × 10-9 fevereiro </sup> • s -1. Como referência, a auto-difusão de HDO em D 2 O foi medida num Hz 2 VARIAN D 2 O padrão da amostra e calibrado para o seu valor padrão. O modelo utilizado para calcular o hidrodinâmico raios R H dos agregados é a relação de Stokes-Einstein para a difusão de uma partícula esférica. 5. Os resultados representativos 1 H-RMN DOSY e as medições de SAXS sobre DTPA-BTA-M (III): objectos esféricos, em tampão de citrato O carácter iónico dos periféricos Gd (III) os complexos introduz frustração no crescimento unidimensional dos monómeros discotic cujo núcleo é concebido para polimerizar em alongadas haste-como agregados. O equilíbrio entre as interacções atractivas e repulsivas controla o tamanho ea forma dos agregados (Esquema 2). Esquema 2. Uma técnica poderosa para determinar o tamanho ea forma de partículas em solução é a fonte de sincrotrão pequeno ângulo de raios-X de espalhamento (SAXS). BTA-Gd (III)-DTPA foi dissolvido numa solução tampão de citrato e os perfis de SAXS foram gravadas e equipado na região 0,01 <q <0,1 Å -1. A inclinação se aproximando de zero na região baixo-q (q <0,06 Å -1) indica uma falta de anisotropia de forma, no total, sugerindo a presença de objetos esféricos (Figura 1). Os dados medidos em diferentes concentrações foram ajustados usando um homogénea monodispersos factor de forma esférica que conduz a um raio calculado, R, de 3,2 nm. O raio calculado geométrica de discotic monomérica BTA-Gd (III)-DTPA é de 3,0 nm, o que sugere a presença de agregados com uma relação de aspecto próxima de 1. <br /> Figura 1. Perfis de SAXS para BTA-Gd (III)-DTPA em tampão citrato (100 mM, pH 6), 0,5 e 1,0 mM (em cima). DOSY RMN de BTA-Y (III)-DTPA em 50 mM tampão d 6-succinato a 1,0 mm (inferior). Clique aqui para ver maior figura . A fim de proporcionar evidência adicional para a forma esférica e nanómetro tamanho dos objectos de auto-montagem, foi realizada uma difusão H-ordenada espectroscopia de RMN (1 H-RMN DOSY) (Figura 1). DOSY-RMN permite a determinação dos coeficientes de difusão de agregados, a partir do qual o raio hidrodinâmico (R H) pode ser calculada. Uma vez que Gd (III) é altamente paramagnético e 1 sinais H seria assim aumentado significativamente, mudamos Gd (III) para diamagnético Y (III). Os coeficientes de difusão do anfifilo diamagnético agregado discotic em um tampão de succinato deuterado (50 mM, PH 6, c = 1 mM) foi determinado para ser 0.69×10-10 m 2 s -1. Via a relação de Stokes-Einstein, calcula-se um raio R hidrodinâmico H de 2,9 nm para os objectos discretas de tamanho esférica (Tabela 1). Este tamanho é em excelente concordância com o valor obtido a partir de dados de SAXS para BTA-Gd (III)-DTPA. BTA-M (III)-DTPA [Mm] D t a [10 -10 m 2 s -1] R H uma [Nm] R b [Nm] 1 0,69 2,9 3,2 um de DOSY; b de SAXS Tabela 1. Resultados de SAXS e medições DOSY para DTPA-BTA-M (III). Cryo-TEM em BTA-Gd (III)-DTPA: a partir de objectos esféricos para nanorods alongadas Outra evidência para o sucesso do controle sobre unidimensional comprimento pilha foi obtido a partir de crio-micrografias TEM. Devido à vitrificação das soluções aquosas criogénico MET preserva a morfologia estrutural dos agregados de auto-montagem e evita a secagem afecta relacionada com a preparação convencional MET amostra. Figura 2 (à esquerda) mostra que BTA-Gd (III)-DTPA produz o esférica esperado objectos com diâmetros cerca de 6 nm, a uma concentração 1 mM, o que confirma os resultados de SAXS e medições DOSY. De acordo com estes resultados, temos sido capazes de obter auto-montagem de objetos discretos que podem ser considerados o equivalente supramolecular de macromoléculas dendríticas 10. . Figura 2 Cryo-TEM imagens para BTA-Gd (III)-DTPA (à esquerda) 1 mM vitrificados a 298 K em tampão citrato (100 mM, pH 6), uma barra de escala representa 50 nm;(À direita) 1 mM vitrificados a 298 K em tampão citrato (100 mM, pH 6) e uma concentração total de NaCl de 5 M, barra de escala representa 50 nm. Até agora, só trabalhou em soluções tamponadas de baixa força iônica. No entanto, se electrostáticas forças repulsivas do periférica carregada M (III)-DTPA complexos em BTA-Gd (III)-DTPA estão na origem do crescimento unidimensional frustrado, esperávamos que o aumento da força iónica do meio tamponado, usando um sal 1:1 inerte com contra-iões altamente hidratadas, deve reduzir as interacções electrostáticas e, portanto, um tipo diferente de auto-montagem objecto deve ser formada. Em tampão de citrato compreendendo 5 M de NaCl este efeito foi realmente observada (Figura 2, direita). A formação de relação de aspecto alto haste-como polímeros supramoleculares é claramente observado na crio-MET micrografias em força iónica elevada. Blindagem electrostática é a explicação mais provável para este achado. As alterações de forma a partir de uma SPHEagregada rical de cerca de 6 nm de diâmetro para hastes alongadas, com um diâmetro de 6 nm e comprimento de até várias centenas de nanómetros. Medições de CD de DTPA-BTA-Gd (III): comutação em cooperação auto-montagem, aumentando a força iónica Dicroísmo circular, espectroscopia (CD) mede a diferença de absorção entre canhotos e destros luz polarizada circularmente. Quando um objecto helicoidal tem um sentido preferido helicoidal, deixou-e destros luz polarizada circularmente será absorvido em diferentes graus, portanto, dando origem a um CD-efeito. Uma vez que as ligações de hidrogénio intermoleculares formado entre consecutivo BTA-Gd (III)-DTPA, dentro dos agregados, são alinhados em uma forma helicoidal eo centro estereogénico na porção L-fenilalanina favorece um sentido helicoidal sobre o outro, espera-se uma clara CD espectro de BTA-Gd (III)-DTPA agregados baseados 11,12. Além disso, dependente da temperatura espectroscopia de CD é um poderosoferramenta para avaliar o mecanismo de auto-montagem de BTA-Gd (III)-DTPA polimerização e permite tirar conclusões sobre a estabilidade dos agregados formados 13. Como um exemplo, o quarto espectros de CD temperatura de BTA-Gd (III)-DTPA (mM 8×10 -3 ou mM 4×10 -3 num tampão de citrato 100 mM) com aumento da concentração salina (0 M de NaCl a 1,0 M de NaCl) são dadas na Figura 3A. Embora uma concentração significativamente inferior é aplicada para as medições de CD, o efeito de algodão claro indica a presença de agregados intactas, mesmo em concentrações micromolares. A forma das alterações espectro de CD sobre o aumento da concentração de sal, que é uma boa indicação para interacções reduzidas na periferia das pilhas e melhor de embalagem das discotics. Além disso, as curvas de CD de arrefecimento das mesmas soluções (363-283 K, medido a λ = 269 ou 278 nm) mostram diferenças distintas de forma (Figura 3B). O appai T e-a temperatura à qual a agregação inicia-se desloca para temperaturas mais elevadas na maior concentração de sal e um mecanismo de cada vez cooperativa, caracterizada por um aumento mais abrupta na CD-efeito, torna-se aparente. Considerando que a curva de arrefecimento a 0 M de NaCl é melhor descrita por um processo de auto-montagem isodésmicas, a curva de arrefecimento a 1,0 M de NaCl é típico para um processo de auto-montagem cooperativa 14. No primeiro caso, todas as constantes de associação são assumidos como sendo igual ao passo que no último caso, a auto-montagem ocorre em pelo menos duas fases distintas. No primeiro passo, um "núcleo" precisa de ser formado, que é energeticamente altamente desfavorável. Após arrefecimento abaixo de uma temperatura de polimerização crítico, alongamento e de crescimento exponencial em polímeros supramoleculares de alto peso molecular segue. Quantificar os parâmetros termodinâmicos do auto-montagem de BTA-Gd (III)-DTPA em 0 e 1 M de NaCl, utilizando um modelo de cooperativa revela claramente a diminuição na K <sub> um, que é a activação adimensional constante 8. Os valores mais baixos para K uma indicam um grau mais elevado de cooperatividade no processo de auto-montagem, que é expresso na formação de polímeros altamente alongadas supramoleculares como observado em crio-MET. BTA-Gd (III)-DTPA C NaCl K um 8 mM x10 -3 0 M 5 10 -2 4 mM x10 -3 1 M 1 10 -4 Tabela 2. Grau de cooperatividade expressa por um K na dependente da temperatura de auto-montagem de BTA-Gd (III)-DTPA como uma função da concentração de NaCl (C NaCl). Figura 3. BTA-Gd (III)-DTPA em um tampão de citrato 100 mM (c = 8 mM x10 -3 em força iónica baixa e 4 mM x10 -3 em força iónica elevada) A] espectros de CD registada a 293 K como uma função da força iónica , c NaCl = 0 M – 1,0 M, a Δε elipticidade molar é calculada como se segue: Δε = CD efeito-/ (cxl), em que c é a concentração de TBA em mol L -1 e l é o comprimento do percurso óptico em centímetros ; B] curvas CD correspondente arrefecimento medidos em λ = 269 nm para 0 M de NaCl e 278 nm para soluções 1 M de NaCl expressa como o grau de agregação Φ n como uma função da concentração de NaCl c NaCl = 0 M – 1,0 M, Φ n é calculado dividindo o efeito medido CD-pelo máxima CD-efeito.