बायोमैटिरियल्स मूत्राशय विभिन्न कृंतक मॉडल में Cystometric विश्लेषण का उपयोग कर वृद्धि के लिए मूल्यांकन
Summary
मूत्राशय वृद्धि के सर्जिकल चरणों से murine और चूहे मॉडल में 3 डी scaffolds का उपयोग वर्णित हैं. मूत्राशय वृद्धि में उपयोग के लिए biomaterial के विन्यास की प्रभावकारिता का परीक्षण करने, दोनों जाग और anesthetized cystometry के के लिए तकनीकों को प्रस्तुत कर रहे हैं.
Abstract
Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and expels it with a precisely orchestrated contraction. A number of congenital and acquired urological anomalies including posterior urethral valves, benign prostatic hyperplasia, and neurogenic bladder secondary to spina bifida/spinal cord injury can result in pathologic tissue remodeling leading to impaired compliance and reduced capacity1. Functional or anatomical obstruction of the urinary tract is frequently associated with these conditions, and can lead to urinary incontinence and kidney damage from increased storage and voiding pressures2. Surgical implantation of gastrointestinal segments to expand organ capacity and reduce intravesical pressures represents the primary surgical treatment option for these disorders when medical management fails3. However, this approach is hampered by the limitation of available donor tissue, and is associated with significant complications including chronic urinary tract infection, metabolic perturbation, urinary stone formation, and secondary malignancy4,5.
Current research in bladder tissue engineering is heavily focused on identifying biomaterial configurations which can support regeneration of tissues at defect sites. Conventional 3-D scaffolds derived from natural and synthetic polymers such as small intestinal submucosa and poly-glycolic acid have shown some short-term success in supporting urothelial and smooth muscle regeneration as well as facilitating increased organ storage capacity in both animal models and in the clinic6,7. However, deficiencies in scaffold mechanical integrity and biocompatibility often result in deleterious fibrosis8, graft contracture9, and calcification10, thus increasing the risk of implant failure and need for secondary surgical procedures. In addition, restoration of normal voiding characteristics utilizing standard biomaterial constructs for augmentation cystoplasty has yet to be achieved, and therefore research and development of novel matrices which can fulfill this role is needed.
In order to successfully develop and evaluate optimal biomaterials for clinical bladder augmentation, efficacy research must first be performed in standardized animal models using detailed surgical methods and functional outcome assessments. We have previously reported the use of a bladder augmentation model in mice to determine the potential of silk fibroin-based scaffolds to mediate tissue regeneration and functional voiding characteristics.11,12 Cystometric analyses of this model have shown that variations in structural and mechanical implant properties can influence the resulting urodynamic features of the tissue engineered bladders11,12. Positive correlations between the degree of matrix-mediated tissue regeneration determined histologically and functional compliance and capacity evaluated by cystometry were demonstrated in this model11,12. These results therefore suggest that functional evaluations of biomaterial configurations in rodent bladder augmentation systems may be a useful format for assessing scaffold properties and establishing in vivo feasibility prior to large animal studies and clinical deployment. In the current study, we will present various surgical stages of bladder augmentation in both mice and rats using silk scaffolds and demonstrate techniques for awake and anesthetized cystometry.
Protocol
Discussion
आरोपण और छोटे पशु मॉडल में मूत्राशय वृद्धि के बाद biomaterial के विन्यास की cystometric मूल्यांकन नैदानिक स्थितियों में उपयोग के लिए मैट्रिक्स डिजाइन के इष्टतम यांत्रिक और संरचनात्मक विशेषताओं की पहचान करने में एक महत्वपूर्ण मान्यता कदम का प्रतिनिधित्व करता है. इस अध्ययन में, हम चूहों और चूहों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से cystometric तकनीक में मूत्राशय वृद्धि प्रदर्शन करने के लिए कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए इंजीनियर अंगों के Urodynamic गुण निर्धारित करने के लिए शल्य चिकित्सा पद्धतियों का वर्णन. हम कई दोनों चूहों और चूहों को शामिल प्रयोगों में इन तकनीकों का उपयोग किया है, प्रत्येक महत्वपूर्ण मुद्दों के बिना 30 + कृन्तकों से मिलकर प्रयोग के साथ. हमारे अनुसंधान प्रयोगशाला बुनियादी वैज्ञानिकों और चिकित्सक सर्जनों की एक विविध समूह है, और स्नातकोत्तर शल्य चिकित्सा प्रशिक्षण के कम से कम 5-6 साल सर्जनों के साथ इन प्रयोगों के प्रक्रियात्मक पहलुओं का प्रदर्शन किया.
Biomaterial के इस्तेमाल के प्रकार, प्रमुख di के बावजूदचूहों की तुलना में चूहों में मूत्राशय बढ़ाने के बीच fference मूत्राशय के आकार है. और biomaterial के विच्छेदन समावेश छोटे मूत्राशय आकार के कारण, अधिक तकनीकी रूप से माउस में मुश्किल है. दृश्य में सहायता, एक शल्य खुर्दबीन इस्तेमाल किया जा सकता है. चूंकि चूहों में मूत्राशय का आकार बड़ा है, यह अधिक स्थितियों में, जहां एक से अधिक प्रक्रिया मूत्राशय (जैसे वृद्धि और cystostomy कैथेटर के स्थान) पर प्रदर्शन किया जा करने के लिए उत्तरदायी है. इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल ऊपर पीई 50-टयूबिंग की 13 चूहे के लिए उपयोग करते हैं, तथापि, यहां तक कि बड़े आकार कैथेटर, पीई-100 इस्तेमाल किया गया है लंबी अवधि के 14 अध्ययन के लिए विशेष रूप से, वर्णन करता है. चूहों में, पीई-10 टयूबिंग के रूप में एक छोटे क्षमता 15,16 उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि छोटे, अधिक लचीला ट्यूबों transducer के लिए दबाव में परिवर्तन सही नहीं संचारित हो सकता है. इसके अलावा, पर कैथेटर हासिल की वैकल्पिक विधि पीठ (8 * ऊपर चरण) मील में किया जाता हैउनके छोटे शरीर के आकार और कुंद टिप सुई और चतुर्थ टोपी के कारण CE के भी बोझिल हैं. इस संज्ञाहरण के लिए की जरूरत है cystometry के लिए पहले चमड़े के नीचे थैली में कैथेटर के अंत निकालने का नुकसान है.
अध्ययनों से पता चला है कि कैथेटर के स्थान के बाद प्रारंभिक पहले दिन (0-4 दिन) में है, cystometry कम voiding संस्करणों के साथ उच्च मूत्राशय दबाव के और overactivity पता चला. इन निष्कर्षों के आसपास 6 7 14,17 दिन को स्थिर दिखाई दिया है और इसलिए, शायद cystometric मूल्यांकन के लिए आदर्श समय है. हालांकि, साहित्य में सबसे अधिक 18 कैथीटेराइजेशन के पहले 3 दिन, और समय सापेक्ष ऊपर मापदंडों में व्यापक बदलाव के लिए इस खाते के भीतर रिपोर्ट cystometry प्रदर्शन. 3 दिन की तुलना में एक लंबी अवधि के लिए suprapubic कैथेटर छोड़कर किया जाता है के साथ यह जोखिम का पत्थर, शत्रु – निर्वासन, संक्रमण, रक्तमेह और मलबे के साथ कैथेटर का रोड़ा जैसे morbidities.
<cystometry दौरान पी वर्ग = "jove_content"> विभिन्न जलसेक दर हैं 15,16 चूहों और 13,19,20 चूहों के लिए 10-11mL/hr के लिए किया गया है 1-3mL/hr से वर्णित हैं. Supraphysiologic जलसेक दर झूठा ऊंचा दबाव 14 पैदा कर सकता है. हम 12.5 μL / मिनट (0.75 एमएल / घंटा) चूहों और 100 μL / मिनट हमारे सेटअप में चूहों के लिए (6 / एमएल घंटा है), लेकिन कम ब्याज दर के लिए भी उपयोग किया जा सकता है की एक जलसेक दर का उपयोग. शारीरिक खारा का तापमान कमरे के तापमान कम से कम होना चाहिए, हालांकि गर्म खारा (37 °) और अधिक क्रम में मूत्राशय ठंड समाधान instilling के साथ उकसाया overactivity से बचने के लिए इष्टतम है. जाग cystometry में, यह महत्वपूर्ण है voiding के पैटर्न के स्थिरीकरण के लिए अनुमति के रूप में जानवर पिंजरे, जो हमारे अनुभव में ~ 10-20 मिनट की अवधि की आवश्यकता करने के लिए समायोजित हो जाता है. इस के बाद, नियमित रूप से बारंबार पेशाब करने की इच्छा चक्र 45-120 मिनट के लिए या कम से कम 3-4 voiding चक्र पर दर्ज किया जा सकता है. पशु वास्तविक समय में देखा जाना चाहिए के बाद से पशु स्वतंत्र रूप से movin हैजी और घुमा या कैथेटर की kinking जैसे जटिलताओं cystometric विश्लेषण को बदल सकते हैं. Cystometry दौरान पर्यावरण शोर सीमित पशु आंदोलन और बाद में कलाकृतियों को कम करने के लिए वांछित है. बेहोश cystometry लिए जाग cystometry के रूप में परिचर समस्याओं नहीं है, करता है, लेकिन कई anesthetics करने के लिए सहज मूत्राशय के संकुचन को रोकना दिखाया गया है. यह निषेध चतनाशून्य करनेवाली औषधि दवाओं की कार्रवाई की उम्मीद की अवधि के लिए सीधे मेल खाती है, यानी जब चतनाशून्य करनेवाली औषधि प्रभाव शांत, सहज संकुचन 14 को फिर से शुरू. इसके अलावा, दबाव मापा जब मूत्राशय overflowed, anesthetized चूहों में सांख्यिकीय अधिक से अधिक थे, दोनों जीवित और पोस्टमार्टम, मूत्राशय दीवार के निष्क्रिय अनुपालन के गुणों पर एक प्रभाव का संकेत है. इस आशय 21 pentobarbital, ketamine के साथ देखा जाता है, और chloralose आईएम / आईपी साँस halothane और intrathecal nesacaine 14 के अलावा. विभिन्न anesthetics के confir के एक अधिक व्यापक अध्ययनमैं बारंबार पेशाब करने की इच्छा पलटा हुआ मध्यम संज्ञाहरण स्तर 17 के तहत दोनों inhalational (isoflurane और methoxyflurane) और barbiturate (pentobarbital हुआ और thiobutabarbital) anesthetics के लिए दमन के साथ इस खोज की. इस प्रभाव में fentanyl-droperidol और ketamine – diazepam के रूप में दवाओं के साथ भी प्रकाश या शामक संज्ञाहरण के स्तर के साथ मनाया गया, और जैसा कि पिछले अध्ययन में, संज्ञाहरण के प्रभाव के रूप में शांत हो गई, तो 17 निषेध किया. इस प्रक्रिया के लिए, urethane intraperitoneal इंजेक्शन के बाद से यह दिखा दिया है कि पलटा बारंबार पेशाब करने की इच्छा करते हुए भी पर्याप्त 17,22 संज्ञाहरण के लिए अनुमति देता है संरक्षित है इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, कोई प्रभाव नहीं बारंबार पेशाब करने की इच्छा 23 के दबाव के सम्मान के साथ मनाया जाता है. Suprapubic कैथेटर नियुक्ति cystometry के लिए यहाँ वर्णित है, बाद से intraurethral कैथीटेराइजेशन उच्च मूत्राशय दबाव घटता है और कम प्रवाह दर के सापेक्ष मूत्राशय आउटलेट 24 बाधा के साथ संगत है दिखाया गया है.इसके अलावा, intraurethral कैथीटेराइजेशन केवल संवेदनाहृत पशुओं में संभव है, और फिर भी, कैथीटेराइजेशन मुश्किल पुरुष rodents और चूहों में विशेष रूप से, हो सकता है.अंत में, मूत्राशय और वृद्धि / या cystometric विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए जो मॉडल की पसंद के विशिष्ट अध्ययन के लक्ष्यों पर निर्भर है. एक तकनीकी दृष्टि से चूहे मॉडल में स्पष्ट रूप से ऊपर चर्चा कारणों के लिए लाभ रखती है. हालांकि, माउस मॉडल मूत्र पथ के रोगों में विशिष्ट जीन इनकोडिंग अंत उत्पादों, आनुवंशिक हेरफेर के लिए अपनी संवेदनशीलता के कारण की भूमिका का मूल्यांकन अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है. यह चूहे में आम तौर पर संभव नहीं है.
जाग cystometry सबसे सही सामान्य शारीरिक राज्य में जो इन जानवरों को उनके बारंबार पेशाब करने की इच्छा चक्र से गुजरना mimics, और हां, तो एक और अधिक विश्वसनीय मूत्राशय समारोह के शारीरिक निर्धारण देने की संभावना है. इसके अलावा, एक confounding चर के प्रत्यक्ष प्रभावमूत्राशय समारोह पर nesthetics बचा है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIDDK T32 DK60442 (Freeman), NIDDK 1K99 DK083616 (Mauney) इन अध्ययनों से भाग में, बच्चों के अस्पताल के बोस्टन मूत्रविज्ञान बंदोबस्ती राजस्व फंड और स्वास्थ्य अनुदान P41 EB002520 एक NIBIB (कापलान) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम वरमोंट के विश्वविद्यालय से डॉ. पीटर Zvara cystostomy ट्यूब प्लेसमेंट और cystometry के लिए तकनीक की स्थापना में सहायता के लिए स्वीकार करते हैं.
Materials
| Materials: | Description/Use: | |||
| Shaving shears | Preparation of rat/mouse for surgery | |||
| Sterile drapes, betadine, 70% ethanol, sterile gauze | Preparation of sterile surgical field | |||
| Instruments: | ||||
| Scalpel blade | Skin incision | |||
| forceps with teeth | Manipulating skin | |||
| Fine forceps | Atraumatic (no teeth), no serrations or with fine serrations to manipulate | |||
| Small needle driver | Sharp tissue dissection | |||
| Metzenbaum scissors | Bldder incision | |||
| Tenotomy scissors | For retraction sutures and to develop subcutaneous tunnel (cystostomy catheter) | |||
| Small curved clamps | Subcutaneous tunnel (cystostomy catheter) | |||
| Sutures: | ||||
| 6-0 polypropylene sutures | Bladder stay sutures and pursestring suture | |||
| 7-0 polyglactin suture | Anastomosis of scaffold to bladder | |||
| 4-0 polyglactin suture | Closure of muscle/skin | |||
| 3-0 or 4-0 Silk suture | Securing catheter tip to skin | |||
| Needles and syringes: | ||||
| 18 Gauge needle | Piercing the bladder for cystostomy catheter | |||
| 25 and 30 Gauge needles | Testing bladder for leakage | |||
| 1 mL saline filled syringe | ||||
| 22 Gauge blunt tip needle | ||||
| Cystostomy catheter: | ||||
| PE-50 tubing | ||||
| Lighter | Flaring PE-50 tubing | |||
| Small curved clamp | Developing subcutaneous tunnel | |||
| Cystometry: | ||||
| MLT844 ADInstruments data capture and LabChart software | Pressure data acquisition | |||
| Harvard 22 syringe pump (Harvard Apparatus, Holliston, MA) | Fluid infusion pump | |||
| Anesthetics (Unconscious cystometry): | ||||
| Isoflurane | Induction/maintenance of general anesthesia | |||
| Urethane | Unconconscious cystometry | |||
| Bupivicaine or equivalent | Local anesthesia | |||
| Meloxicam | Post-operative analgesia | |||
| Buprenorphine | Post-operative analgesia | |||
References
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