Summary
在小鼠和大鼠模型，用三维支架膀胱扩大术的手术阶段。为了测试在膀胱扩大术中使用的生物材料配置的功效，膀胱清醒和麻醉技术。
Abstract
肾功能和尿尿失禁是严重依赖上，存储在低气压的尿液和排出精确策划收缩膀胱的正常功能。包括后尿道瓣膜，良性前列腺增生症，脊柱裂/脊髓损伤继发神经源性膀胱的先天和后天的泌尿系统异常可能导致病理组织重塑导致受损遵守和能力下降1。尿路梗阻功能性或解剖经常与这些条件，可能导致尿失禁和肾损害增加的储尿及排尿压力2。手术植入胃肠道段，扩大器官的能力，降低膀胱内压力表示为这些疾病的主要手术治疗选项时，医疗管理失败3。然而，这种做法是阻碍教育署提供捐助组织的限制，并与包括代谢扰动，慢性尿路感染，泌尿系结石的形成，和继发恶性肿瘤4,5显着的并发症。
膀胱组织工程的研究现状在很大程度上侧重于查明缺陷的网站，可以支持组织再生的生物材料配置。传统的3-D支架来自天然和合成聚合物，如小肠黏膜下层和聚乙醇酸的显示支持以及促进上皮和平滑肌再生器官在动物模型的存储容量增加，在一些短期的成功诊所6,7。然而，在支架的机械完整性和生物相容性的缺陷往往导致移植挛缩9，8，有害纤维化和钙化10，从而增加了植入失败的风险和需要FOŕ二次手术。此外，恢复正常排尿的特点，利用标准的生物材料的结构，增强膀胱成形术尚未实现，因此，研究和发展新型的矩阵可以发挥这种作用是必要的。
为了成功地开发和评价，为临床膀胱扩大术的最佳生物材料的研究，疗效必须首先进行标准化动物模型，利用详细的手术方法和功能结果评估。我们以前曾报道在小鼠膀胱扩大术模型使用基于丝素蛋白支架的潜力，以确定调解组织再生和功能性排尿的特点。11,12膀胱这种模式的分析显示，在结构和机械的植入性能的变化可以影响11,12的组织工程膀胱的尿流动力学特征。积极correlations之间的基质介导的组织再生的程度决定组织由膀胱 功能合规性和能力评估，证明在这个模型中11,12。因此，这些结果表明，在啮齿类动物膀胱增强系统的生物材料配置功能的评价可能是一个有用的格式脚手架性能评估和建立之前，大量的动物实验研究和临床部署在体内的可行性。目前的研究中，我们将介绍使用蚕丝支架在小鼠和大鼠膀胱扩大术的各种手术阶段，并表现出的清醒和麻醉膀胱技术。
Protocol
手术方法
1。术前准备和麻醉
- 设立必要的手术器械无菌手术领域：剃剪，牙钳，细无创伤钳，细针驱动器，纱布，梅岑鲍姆剪刀，切断术剪刀，手术刀刀片，30号注射器针头，盐水填充1毫升注射器，四6-0聚丙烯缝线polyglactin缝合，7-0，4-0 polyglactin缝合。
- 动物麻醉与异氟醚吸入诱导室。转移到手术领域之前，确认完整的动物感应。确保在适当的位置，有连续的麻醉吸入麻醉管。
- 将动物仰卧在无菌的悬垂性。
[膀胱分析，请参阅下面的一段隧道廔导管。] - 使用剃须剪删除从下腹部的皮毛。
- 准备的是腹部tadine和70％的乙醇。
- 前切口，如丁丙诺啡（0.05-0.1毫克/公斤）镇痛可皮下注射围手术期疼痛控制。
2。膀胱切口和曝光
- 做一个1-2厘米（动物的大小，取决于是否大鼠或小鼠）较低正中切口，通过皮肤的手术刀。深化在较低的部分通过的直肌采取小心，不要伤害底层肠或膀胱肌肉切口的切口。
- 用齿镊，提升直肌和免费后表面的肌肉解剖与细梅岑鲍姆剪刀。
- 切开的肌肉在整个长度的皮肤切口中线的其余部分。
- 提供通过膀胱切口（ 图1）。膀胱通常是在骨盆最依赖的器官。 （在男性中，前列腺实际上是更加依赖和较大的比解压膀胱）。
- 通过膀胱后壁缝合的地方之一逗留，然后通过另一个用6-0聚丙烯缝线膀胱前壁。横向放置额外的缝合。不要把这些缝合。当缝线拉紧，膀胱，将有一个方形的配置，测量约1厘米2（ 图2）。要小心，因为他们可以很容易地通过膀胱组织拉不会有太多这些缝线的张力。
- 纵向切开膀胱，通过前约1厘米（1.5-2厘米）在大鼠膀胱膀胱壁在中线（只逊色于膀胱圆顶）。
3。吻合脚手架
- 用细剪刀，修剪丝绸脚手架膀胱缺损的近似面积。
- 使用缝线7-0 polyglactin，开始在一个角落里的脚手架缝合膀胱，在连续运行时尚创建一个防水密封周围所有的缺陷的方式（ 图3）。
- 测试用无菌生理盐水填充灌输它通过用30号注射器针头膀胱壁膀胱吻合的完整性。如果发现泄漏，这是可以关闭额外中断7-0 polyglactin的缝合以缩小差距。
- 减少到腹部的重建膀胱后面。
4。切口封闭
- 关闭腹壁之前，注入局部麻醉下直肌和皮下组织（<3毫克/千克为0.25％）与布比卡因。
- 重新估算一个连续运行4-0 polyglactin的缝合直肌。
- 关闭一个连续运行4-0 polyglactin的缝合皮肤。
- 清洁和干燥的切口（ 图4）。
- 转移到温暖，从麻醉中苏醒的清洁笼子的动物。 廔导管置入膀胱分析的步骤如下：
- 设立必要的手术器械的无菌医疗器械领域：剃剪，牙钳，精细的无创伤钳，细针驱动器，纱布，梅岑鲍姆剪刀，切断术剪刀，小弯钳，手术刀刀片，6-0聚丙烯，4-0 3-0丝线缝合（4-0丝线缝合小鼠），18G针头，22G钝尖针头，25G针头，1 mL生理盐水填充注射器，50聚乙烯管材（PE-50）polyglactin缝合，切割长度为〜10厘米。
- 耀斑的PE-50管，轻轻地暴露在火焰。小心融化年底关闭或闭塞的管腔（这可以通过连接到“非喇叭形”结束1 25G针注射生理盐水，确保流动验证）。作为一个锚，以保持膀胱内管（ 图5）。
- 使用剃须剪消除双方之间的肩胛骨和小腹上ventrum动物背部的皮毛。
- 准备方面的优碘和70％的乙醇。将动物俯卧悬垂。
- 肩胛骨之间的背部做一个1厘米的切口。梅岑鲍姆剪刀，发展之间的皮肤和底层肌肉的飞机，在飞机上放置剪刀的技巧和传播他们创造一个隧道，周围腹腹部。
- 调运动物仰卧。使你的腹部切口，暴露膀胱以上步骤2.1-2.4。减少膀胱背部到腹部。
- 放置到你的皮下隧道在步骤5.6从你的背部皮肤切口开始创建的小卡子。用你的手指，以保护通过腹壁进入腹部钳提示腹腔内的内容，皮尔斯。
- 抓住了Smooth年底的PE-50管钳，拉回到通过背侧切口。确保不拉过去的腹壁（ 图6），bulbed年底。
- 提供通过膀胱切口。从这个角度上，应处理膀胱细钳，膀胱，可能导致损坏或炎症，以防止外伤可以歪斜你的的膀胱结果或结果在动物手术后的不适。
- 请注意廔管的建议网站。它应该被放置在膀胱圆顶（优越的扩充段）。这将防止扭结管或闭塞。
- 用6-0聚丙烯缝线，放置1 pursestring针在膀胱圆顶以下列方式：第一掷，通过纵向的膀胱壁外侧廔管的选址。一个松散年底离开小钳，使缝合时不小心拉，一路过关斩将。放置在横向方向的下一个罚球，开始先进入膀胱壁略横向到你的第一个罚球的出口。
- 不要拉缝线拉紧。你未来的缝合平行放置到你的第一个（纵向）进入膀胱刚刚头侧到你最后的出口，横向缝合网站的。第四次罚球将开始横向到最后缝合和结束对你的第一罚球入口旁的出口。做正确的，这个网站（ 图7）拟议导管周围形成环形广场。
- 使用18G的针头刺破膀胱壁的中心的pursestring缝合。要小心，不要刺入太深（刚好是腔内）。放置在开放的罚款钳提示，轻轻蔓延扩大的洞。
- 插入在缺陷的导管bulbed的膀胱，直到它是腔内。拉导管周围的pursestring缝合紧密配合下来。这应该肚带保持它在的地方（ 图8）的导管周围的膀胱壁。
- 采取一端缝合和环绕导管一次和配合下，进一步巩固导管。
- 用1毫升注射器和25G的针头，针插入油管慢慢注入生理盐水胀大的膀胱。观察周围的导管漏水。一旦你看到从尿道泄漏，吸生理盐水再次解压膀胱。
- 以上步骤4.1-4.4关闭腹部切口。
- 调运动物容易。
- 削减的皮肤用剪刀水平导管管。插入22G钝钛带够针进油管。
- 4-0 polyglactin在运行方式，在油管关闭的皮肤。离开枢纽针从皮肤挤出。
- 将钝针的静脉线帽。用3-0丝线缝合，保护皮肤的导管尖端（ 图9）。
- 清洁切口。转移到温暖，从麻醉中苏醒的清洁笼子的老鼠。
- *扭结或用火焰融化结束闭塞的导管末端。
- *线圈结束的油管，并留在皮下囊动物的背（不要切断油管缩短）（ 图10）。
- *关闭了油管的皮肤，在运行方式的4-0 polyglactin（ 图11）。
- *在的膀胱一天，准备用优碘和70％的乙醇背侧切口。麻醉下打开背侧切口，去除皮下袋的连续油管。关闭切口。从麻醉中醒来动物和执行时，它是完全清醒的膀胱。
- 安装与数据采集和分析与LabChart V6（ADInstruments）和输液哈佛22注射泵（哈佛Appara描述与MLT844 ADInstrumentsHolliston，MA），土族，虽然其他类似的系统（ 图12）。
- 校准基于两个音量膀胱系统的规格和压力。
- 将暂停以上规模的代谢笼（与丝网地板的笼子）的动物。连接到传感器的规模。
- 清除任何气泡系统，并确保从输液泵的连续流。
- 连接计算机数据采集系统，并观察数据的踪迹。相应地调整规模。膀胱压力和尿量将连续记录。
- 访问与通过T型管连接压力传感器和输液泵1 27G针头耻骨上导管。 12.5微升/分钟的鼠标和100μL/分钟大鼠在开始输注生理盐水。
- 允许的排尿模式，跟踪稳定（膀胱压力上升，由一个void）。这通常需要大约mately 10-20分钟。记录排尿周期为45-120分钟，或至少3-4排尿周期。
- 观察实时并发症，这将导致工件（即导管扭结，阻塞等;见下文讨论）来解决整个过程。
- 停止输液，导管从系统中断开，并返回笼子里的动物。
- 麻醉与聚氨酯（1-2克/公斤）腹腔注射（IP）的动物。
- 暴露的膀胱以上步骤1.3-2.4。
- 在步骤9.2校准系统。准备步骤9.4-9.5系统。
- 插入27G的针通过一个T型管连接压力传感器和膀胱侧面输液泵。
- 记录排尿周期为45-90分钟。
- 停止输液，从膀胱中取出针和安乐死的动物。</ LI>
5。隧道廔导管
6。配售的廔管
7。测试的导管和关闭腹部切口
8。关闭背切口，将导管（老鼠）
8。*闭幕背切口，将导管（小鼠或大鼠）
9。代表结果 - 手术方法
重建膀胱应该尽可能防水，以避免一个重大的尿漏（ 图3）有关的并发症。疼痛或不适通常发抖或刮伤，并在腹部切口啃的清单。这可以皮下注射美洛昔康（0.5-1.0毫克/千克皮下）非甾体类抗炎等日常管理。通常情况下，动物只需要注射手术后第3天。这可与阿片类药物丁丙诺啡（0.05-0.1毫克/公斤皮下注射，每8-12小时），如需要补充。应监测动物，每日3次，手术后第3天，总重量手术后3-5天每天冰然后每天此后，疼痛，感染的迹象，充足的伤口愈合，活动，梳洗，和皮肤膨评估。抗生素（Baytril，按5mg/kg皮下量不超过0.1毫升每24小时）的第一个72小时的手术后，对手术预防感染。正常复苏的迹象是行走和活动的正常水平，适当的喂食和饮水，疼痛或痛苦的情况下（不发声）和与cagemates正常的社会。应前膀胱分析给出一个至少5-7天的恢复时间，使膀胱愈合，减少炎症，这可能会影响结果。
膀胱分析
10。醒来膀胱分析
11。昏迷的膀胱分析（无耻骨上导管）
12。代表性成果 - 膀胱分析
尿动力学轨迹，然后可以分析得出作废卷，合规性，峰值排尿压力，除收缩区间，排尿周期后无效残留量等参数。
cystometrogram可分为馅和排尿阶段。一个正常的灌浆阶段是排尿周期的部分在膀胱膀胱内压力的变化很小罢了。正常排尿阶段的跟踪，由相应的收缩，膀胱内的压力在稳步上升。最高压力达到期间跟踪排尿阶段被称为高峰排尿压力。高峰排尿压力，可以建议梗阻性排尿模式，hypercontractile膀胱或在SP导管扭结。可以计算出符合收购量注入杜里比例吴灌装阶段和压力（标准=ΔV/△P）的变化。一个hypocompliant膀胱之一，是无法容纳足够的尿量低的压力。 intercontraction间隔可以计算分析上的cystometrogram看到两收缩时间。短intercontraction间隔是暗示膀胱刺激。排尿周期时间是指整个灌装和排尿阶段完成，并可以很容易地跟踪分析确定所需的时间。在膀胱的结论，后残余尿量（PVR），可以得到。这是通过吸气后完成一个收缩的耻骨上导管。这些参数有助于客观的调查研究膀胱动态填充和清空膀胱。
腹部手术切口的照片图1。膀胱和挤压。
图2。膀胱膀胱腔暴露的切口。
图3。植入到膀胱壁的整合。
图4。封闭切口的照片。
图5。扩口端的PE-50管。
图6。PE-50管（导管）通过背切口。
图7。pursestring缝合。
图8。保护导管到膀胱。
图9。抵押导管枢纽。
图10。盘绕在皮下囊管。
图11。背切口倒闭。
图12例膀胱设置。
图13。代表膀胱跟踪。
Discussion
生物材料配置膀胱后植入膀胱扩大术在小动物模型的评价，表示验证确定在临床情况下使用的结构优化和矩阵设计的机械特性的重要一步。在这项研究中，我们描述手术方法进行膀胱增强小鼠和大鼠以及膀胱技术工程器官功能评估，以确定尿动力学性能。我们利用这些技术涉及多个实验小鼠和大鼠中，每30无显著问题+的啮齿动物组成的实验。我们的研究实验室是一个基本的科学家和医生外科医生的多元化企业集团，并具有至少5-6年毕业后手术培训的外科医生进行这些实验的程序方面。
无论生物材料的使用，主要DI型在大鼠与小鼠膀胱之间增强fference是膀胱的大小。由于到膀胱规模较小，解剖和生物材料掺入更多的鼠标在技术上困难。为了帮助在可视化，手术显微镜可以使用。由于在大鼠膀胱的大小越大，它更适合有多个程序的情况下要对膀胱（如隆胸和安置廔导管）执行。此外，协议上面介绍了利用大鼠13的PE-50管，但是，更大的大小导管，尤其是长期研究14 PE-100已经使用。在小鼠实验中，如体育-10油管的小口径可以利用15,16，但应牢记，更小，更柔韧的管可能没有压力的变化传送到传感器准确。此外，确保导管的替代方法的背（*以上步骤8）在MICE由于其体型较小，钝尖的针和四帽是太麻烦了。这个缺点是需要提取年底前膀胱导管在皮下囊麻醉。
有研究表明，在最初的第一天（0-4天）后放置导管，膀胱透露与高膀胱排尿量低的压力和过度。这些研究结果出现周围第六稳定第七天14,17，因此，可能是膀胱评价的理想时机。然而，在文献中的大多数报告进行膀胱导尿18第3天，在上述时间相对参数变化的户口本内。离开了超过3天的持续时间更长的耻骨上导管带有并发症，如结石的风险，移位，感染，血尿和闭塞的导管碎片。
<类p =的“jove_content”>不同输注速率在 膀胱已经从1-3mL/hr为15,16小鼠和大鼠13,19,20 10-11mL/hr。超生理输注速率可引起假性升高的压力14。我们使用输注率12.5μL/分钟（0.75毫升/小时）小鼠和100微升/分钟（6毫升/小时）大鼠在我们的设置，但较低的利率还可以利用。生理盐水的温度至少应为室温，虽然温水（37℃）生理盐水是为了避免膀胱过度挑起与灌输冷解决方案更优化。在清醒的膀胱，关键是要稳定的排尿模式使动物成为调整的笼子里，在我们的经验需要一段时间约10-20分钟在此之后，定时排尿周期可以记录45-120分钟，或至少3-4排尿周期。动物应实时观察，因为动物是自由舞动g和并发症，如导管扭曲或扭结可以改变膀胱分析。环境噪声限制在膀胱希望减少动物运动和随后的文物。无意识的膀胱不会有清醒膀胱随之而来的问题，但多个麻醉药已被证明能抑制自发性膀胱收缩。这种抑制作用直接对应的麻醉药品的行动预计持续，即当麻醉效果消退，恢复自发性收缩14。此外，膀胱溢出时，测量的压力，在麻醉大鼠统计学更大，都活着和验尸报告，表明对膀胱壁的被动遵守属性的效果。这种效果被视为与21巴比妥，氯胺酮和氯醛糖IM / IP协议，除了吸入氟烷和鞘内nesacaine 14的 。一个各种麻醉药confir的更广泛的研究M这个发现在温和的麻醉水平17（同时吸入异氟醚和甲氧）和巴比妥（苯巴比妥和thiobutabarbital）麻醉药抑制排尿反射。这种效应甚至轻或镇静麻醉药物，如芬太尼，氟哌利多和氯胺酮地西泮水平观察，在以往的研究中，麻醉效果消退，所以没有抑制17。此过程中，乌拉坦腹腔注射可以使用，因为它已被证明，反射排尿保留，同时也允许适当的麻醉17,22。此外，没有任何效果观察排尿压力23。耻骨上膀胱导管放置这里所描述的，因为尿道导管已被证明有较高的膀胱压力曲线和较低的流速相对膀胱出口梗阻24。此外，尿道插管，仅在麻醉动物是可行的，即使在当时，导管可以是困难的，尤其是雄性老鼠和小鼠。总之，用于膀胱扩大术和/或膀胱分析该模型的选择是依赖于具体的研究目标。从技术角度大鼠模型清楚地持有上述原因的优势。然而，在小鼠模型可用于研究评估尿路疾病的特定基因编码的高端产品，由于其易感性基因操纵的角色。这不是一般在大鼠可行的。
清醒膀胱最准确地模仿这些动物接受他们的排尿周期正常的生理状态，所以，很可能给一个更可靠的膀胱功能的生理测定。此外，混杂变量的直接影响膀胱功能nesthetics是可以避免的。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这些研究经费，一部分，由波士顿儿童医院泌尿外科捐赠收入基金和国家机构的医疗补助NIBIB P41-EB002520（卡普兰）; NIDDK的T32-DK60442（弗里曼）; NIDDK 1K99-DK083616（Mauney）。我们承认，从佛蒙特大学建立廔管安置和膀胱的技术援助医生彼得Zvara。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaving shears | Preparation of rat/mouse for surgery | ||
| Sterile drapes, betadine, 70% ethanol, sterile gauze | Preparation of sterile surgical field | ||
| Instruments: | |||
| Scalpel blade | Skin incision | ||
| forceps with teeth | Manipulating skin | ||
| Fine forceps | Atraumatic (no teeth), no serrations or with fine serrations to manipulate | ||
| Small needle driver | Sharp tissue dissection | ||
| Metzenbaum scissors | Bldder incision | ||
| Tenotomy scissors | For retraction sutures and to develop subcutaneous tunnel (cystostomy catheter) | ||
| Small curved clamps | Subcutaneous tunnel (cystostomy catheter) | ||
| Sutures: | |||
| 6-0 polypropylene sutures | Bladder stay sutures and pursestring suture | ||
| 7-0 polyglactin suture | Anastomosis of scaffold to bladder | ||
| 4-0 polyglactin suture | Closure of muscle/skin | ||
| 3-0 or 4-0 Silk suture | Securing catheter tip to skin | ||
| Needles and syringes: | |||
| 18 Gauge needle | Piercing the bladder for cystostomy catheter | ||
| 25 and 30 Gauge needles | Testing bladder for leakage | ||
| 1 mL saline filled syringe | |||
| 22 Gauge blunt tip needle | |||
| Cystostomy catheter: | |||
| PE-50 tubing | |||
| Lighter | Flaring PE-50 tubing | ||
| Small curved clamp | Developing subcutaneous tunnel | ||
| Cystometry: | |||
| MLT844 ADInstruments data capture and LabChart software | Pressure data acquisition | ||
| Harvard 22 syringe pump (Harvard Apparatus, Holliston, MA) | Fluid infusion pump | ||
| Anesthetics (Unconscious cystometry): | |||
| Isoflurane | Induction/maintenance of general anesthesia | ||
| Urethane | Unconconscious cystometry | ||
| Bupivicaine or equivalent | Local anesthesia | ||
| Meloxicam | Post-operative analgesia | ||
| Buprenorphine | Post-operative analgesia | ||
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