Kvantitativ fitnessanalyse (QFA) er en komplementær serie eksperimentelle og beregningsmetoder for estimering av mikrobielle kultur fitnesses. QFA anslår effekten av genetiske mutasjoner, narkotika eller andre gjaldt behandlinger på mikrobe vekst. Eksperimenter skalering fra fokusert analyse av single kulturer til tusenvis av parallelle kulturer kan utformes.
Kvantitativ fitnessanalyse (QFA) er en eksperimentell og beregningsorientert arbeidsflyt for å sammenligne fitnesses av mikrobielle kulturer dyrket parallelt 1,2,3,4. QFA kan brukes fokuserte observasjoner av single kulturer, men er mest nyttig for genom-wide genetisk interaksjon eller narkotika-skjermer undersøke opptil tusenvis av uavhengige kulturer. Den sentrale eksperimentelle metoden er den inokulering av uavhengige, fortynnede væske mikrobielle kulturer inn på solide agar plater som ruges og regelmessig fotografert. Fotografier fra hver gang-punkt blir analysert, produserer kvantitative celletetthet estimater, som brukes til å konstruere vekstkurver, slik at kvantitative fitness tiltak for å bli utledet. Kultur fitnesses kan sammenlignes å kvantifisere og rangere genetisk interaksjon styrker eller narkotika overfølsomhet. Effekten på kultur egnethet av eventuelle behandlinger lagt inn substrat agar (f.eks små molekyler, antibiotika eller næringsstoffer) eller påføres plater utvendigly (f.eks UV bestråling, temperatur) kan kvantifiseres ved QFA.
Den QFA arbeidsflyten produserer vekst anslår analogt til de som er fremstilt ved spektrofotometrisk måling av parallelle flytende kulturer i 96-brønn eller 200-brønnen plate lesere. Viktigere, har QFA betydelig høyere gjennomstrømning sammenlignet med slike metoder. QFA kulturer vokse på en solid agaroverflaten og er derfor godt luftet under vekst uten behov for å røre eller riste.
QFA gjennomstrømning er ikke så høy som i noen Syntetisk Genetisk Array (SGA) screening metoder 5,6. Men siden QFA kulturer er sterkt fortynnet før de inokulert på agar, kan QFA fange mer komplette vekstkurver, inkludert eksponential og metning faser tre. For eksempel, vekstkurve observasjoner tillate kultur dobling ganger til estimeres direkte med høy presisjon, som omtalt tidligere en.
Her presenterer vi enspesifikk QFA protokollen brukt tusenvis av S. cerevisiae kulturer som håndteres automatisk av roboter under inokulasjon, inkubasjon og bildebehandling. Alle disse automatiserte tiltak kan erstattes av en tilsvarende, manuell prosedyre, med en tilhørende reduksjon i gjennomstrømning, og vi også presentere en lavere gjennomstrømming manuell protokoll. De samme QFA programvare verktøy kan brukes til bilder tatt i enten arbeidsflyt.
Vi har lang erfaring søker QFA til kulturer i spirende gjær S. cerevisiae men vi forventer at QFA vil være like nyttig for å undersøke kulturer av fisjon gjær S. pombe og bakteriekulturer.
QFA er på mange sanser en direkte etterkommer av tre etablerte benk-skala mikrobiologiske teknikker: kultur fortynning serien stikkprøver 9, vekstkurve bestemmelse i karbonisert flytende kulturer 9 og kopi plating 13. Disse tre metodene er oppsummert og sammenlignet med QFA og andre high-throughput teknikker i tabell 2. Mens fortynning serien stikkprøver definere en belastning egnethet som evne til å danne kolonier i en rekke kulturer vokst fra en rekke podestoff fortynninger, til QFA tiltak belastningen fitness ved gjentatte observasjoner av en enkelt kultur konstruere en vekst kurve. Kvantifisering fitness fra enkle kulturer kan mange flere stammer skal undersøkes samtidig, under identiske forhold. Innlæring matriser av kulturer tillater gjentatt testing av belastningsskader samlinger, mest nyttige ting når jeg tester for kultur fitness forskjeller i ulike miljøer eller genetiske bakgrunn. Den QFA protokollen presenterther bruker dyrt robot-utstyr å gjenskape, vaksinere, inkuber og bilde agar plater, passende for å observere vekst av tusenvis av uavhengige kulturer (robot QFA, tabell 2). Men siden QFA er basert på etablerte, tradisjonelle lab teknikker, kan det også utføres mye billigere ved å erstatte robot hjelp med manuelle trinn (manuell QFA, tabell 2). Manuell QFA innebærer replikering og poding av kulturer inn på agar plater ved hjelp av en manuell pin verktøy og manuell overføring av platene til og fra en inkubator for fotografering. Det samme beregningsanalyse arbeidsflyten kan brukes til å generere vekstkurver fra enten eksperimentelt design.
QFA fitness anslag synes å være relativt presise. I figur 4 er gjennomsnittlig fitnesses av fire eksempel klynger av funksjonelt beslektede gener slettinger uthevet. Nærheten av medlemmer av hvert funksjonelt beslektede gener klassen i to uavhengigeskjellige genetiske bakgrunn (ura3Δ og cdc13-1) angir reproduserbarhet QFA fitness estimater. For eksempel bare tre genet slettinger (ut av en mulig 4300) skiller de tre medlemmene av konservert MRX komplekset.
High-throughput alternativer til QFA for testing vekstkarakteristikker av mikrobielle stammer inkluderer 5,6 SGA, konkurranse skjermer i strekkodet biblioteker 11,12 og skjermer fange optisk tetthet kinetikk i Spektrofotometrisk plate lesere 10 som er oppsummert i Tabell 2 og beskrevet mer fullstendig annet sted 8 . QFA og SGA plater, der kulturer vokser på solide agar overflater (agar baserte metoder, tabell 2) kan håndteres raskt og enkelt ved robot. Solid agaroverflaten kulturer er godt luftet gjennom vekst og cellene kan vokse i faste kulturer, slik at sosiale mikrober å vokse i et fellesskap 14. Intakt, mikrobielle samfunn etffect sin egen mikro-miljøer, sekresjon giftstoffer som etanol, og muligens signalering mellom cellene. Men kontinuerlig blanding av flytende kulturer, nødvendige for å oppnå tilstrekkelig lufting, kunstig forstyrrer mikrobielle samfunn og deres mikro-miljøer som kan påvirke deres moduser av vekst. Cross-forurensning er mindre av en bekymring i solide agar metoder siden det er mindre mulighet for væskesprut frakter celler mellom kulturer. Dersom forurensning skjer ved utenlandske luftbårne mikrober i solide agar-analyser, kan det ofte bli oppdaget ved visuell inspeksjon av faste agar plater og sto for eller fjernet.
QFA gjennomstrømning er betydelig høyere enn for parallelle flytende metoder på to måter. Først av alt, på QFA (og SGA) plater, er inokulerte kulturer pakket sammen tettere, noe som gir mer selvstendige kulturer per plate. I QFA er det vanligvis 308 kulturer, ikke medregnet ikke-eksperimentelle edge kulturer (figur 1) comsammenlignet med parallell flytende kulturer med 96 eller 100 kulturer per plate. Dernest kan QFA eksperimenter bli skalert til en mye større antall plater. Mens antall plater analysert i en enkelt QFA eksperiment er bare begrenset av tilgjengelig plass i en inkubator eller varme rom, minstekravet Image Capture frekvens og høyest oppnåelige fangst frekvens, er antall plater i en væske vekst eksperiment sterkt begrenset av kapasiteten på plateavleseren (vanligvis én eller to plater), eller av stabler festet til plateavleseren (typisk 25-50 plater). Vi har nylig gjennomført en helautomatisk QFA eksperiment på 123 plater, hver med 308 eksperimentelle kulturer, noe som gir 37,884 samtidige kulturer. Vi anslår at maksimalt oppnåelig antall uavhengige kulturer vokser i flytende er 96 (kulturer / plate) x 50 (plater / stabling) = 4800, som er rundt ti ganger mindre enn vår QFA gjennomstrømming. Et alternativ for flytende kultur skjermer er å utnytte mange automatisert growth enheter i parallell (tabell 1 fra gjennomgangen av Blomberg 8), som hver har en kapasitet på en eller to plater. Temperaturkontroll i hver enhet er uavhengig, og så forholdene er ikke identiske, men forutsatt at de er, ville dette arbeidsflyten krever minst 190 slike enheter for å matche QFA gjennomløp (forutsatt 200 flytende kulturer per enhet).
Oppsummert er QFA en høy kvalitet arbeidsflyt som kan nyttiggjøre å samle kvantitative vekst fenotyper i begge småskala fokusert eksperimenter og høy gjennomstrømning skjermer. Det er fleksibelt nok til å brukes effektivt med varierende krav til robot utstyr. Den beregningsorientert komponenten av QFA arbeidsflyten er basert på fritt tilgjengelig, åpen kildekode.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke for alle medlemmer i vårt laboratorium og Senter for integrert system Biology of Ageing and Nutrition (CISBAN) for støtte og nyttige diskusjoner. Denne studien ble støttet av bioteknologi og Biologisk Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) og Wellcome Trust (075294, 093088).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.