के मात्रात्मक स्वास्थ्य विश्लेषण (QFA) माइक्रोबियल संस्कृति fitnesses का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल विधियों के पूरक श्रृंखला है. QFA आनुवंशिक परिवर्तन, दवाओं या अन्य सूक्ष्म जीव विकास पर लागू उपचार के प्रभाव का अनुमान है. प्रयोगों एकल संस्कृतियों का ध्यान केंद्रित विश्लेषण से समानांतर संस्कृतियों के हजारों करने के लिए स्केलिंग बनाया जा सकता है.
Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.
QFA कई होश में प्रत्यक्ष तीन स्थापित सूक्ष्मजीवविज्ञानी बेंच पैमाने पर तकनीक के वंशज: संस्कृति कमजोर पड़ने श्रृंखला हाजिर 9 परीक्षण, विकास हैं वातित तरल 9 संस्कृतियों और प्रतिकृति चढ़ाना 13 में वक्र दृढ़ संकल्प है. इन तीन तरीकों संक्षेप और QFA और तालिका 2 में अन्य उच्च throughput तकनीक के साथ तुलना कर रहे हैं. जबकि कमजोर पड़ने श्रृंखला स्थान परीक्षण इसके inoculum dilutions की एक सीमा से हो संस्कृतियों की एक श्रृंखला में कालोनियों के रूप में करने की क्षमता के रूप में एक तनाव फिटनेस को परिभाषित करने के लिए, एक ही संस्कृति के दोहराया टिप्पणियों के द्वारा QFA उपायों तनाव फिटनेस विकास वक्र का निर्माण. एकल संस्कृतियों से फिटनेस बढ़ाता अधिक कई उपभेदों के साथ जांच करने के लिए समान शर्तों के तहत, अनुमति देता है. संस्कृतियों की नकल arrays तनाव संग्रह, सबसे उपयोगी दोहराया परीक्षण की अनुमति देता है जब संस्कृति अंतर के लिए अलग अलग वातावरण या आनुवंशिक पृष्ठभूमि में फिटनेस परीक्षण. QFA प्रोटोकॉल प्रस्तुतयहाँ महंगा रोबोट उपकरण का उपयोग करता है को दोहराने के लिए, टीका लगाना, सेते हैं और छवि अगर प्लेटों, स्वतंत्र संस्कृतियों (QFA रोबोट, तालिका 2) के हजारों के विकास के अवलोकन के लिए उपयुक्त है. हालांकि, के बाद से QFA की स्थापना की, परंपरागत प्रयोगशाला तकनीकों पर आधारित है, यह भी बाहर किया जा सकता है बहुत अधिक सस्ते मैनुअल के चरणों का (पुस्तिका QFA, तालिका 2) के साथ रोबोट सहायता की जगह द्वारा. पुस्तिका QFA और अगर प्लेट पर संस्कृतियों पुस्तिका पिन उपकरण और करने के लिए और फोटोग्राफी के लिए एक मशीन से प्लेटों के मैनुअल हस्तांतरण का उपयोग कर की प्रतिकृति टीका शामिल है. एक ही कम्प्यूटेशनल विश्लेषण कार्यप्रवाह या तो प्रयोगात्मक डिजाइन से विकास घटता उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है.
QFA फिटनेस के अनुमानों के अपेक्षाकृत सटीक होने लगते हैं. चित्रा 4 में कार्यात्मक संबंधित जीन विलोपन के चार उदाहरण समूहों का मतलब fitnesses डाला जाता है. दो independ में प्रत्येक कार्यात्मक संबंधित जीन वर्ग के सदस्यों के करीब निकटताईएनटी आनुवंशिक पृष्ठभूमि (ura3Δ और cdc13-1) QFA फिटनेस अनुमान के reproducibility इंगित करता है. उदाहरण के लिए, केवल 3 जीन विलोपन (बाहर एक संभव 4300) संरक्षित MRX परिसर के तीन सदस्यों को अलग.
माइक्रोबियल उपभेदों के विकास विशेषताओं का परीक्षण करने के लिए उच्च throughput QFA के लिए विकल्प SGA 5,6, में barcoded पुस्तकालयों में प्रतिस्पर्धा 11,12 स्क्रीन और स्क्रीन spectrophotometric प्लेट पाठकों में ऑप्टिकल घनत्व कैनेटीक्स पर कब्जा शामिल हैं 10 जो तालिका 2 में संक्षेप हैं और अधिक पूरी तरह से 8 कहीं वर्णित . QFA और SGA प्लेटें, जहां संस्कृतियों ठोस अगर सतहों (अगर आधारित विधियों, तालिका 2) बढ़ने पर रोबोट द्वारा जल्दी और आसानी से संभाला जा सकता है. ठोस अगर सतह संस्कृतियों को अच्छी तरह से विकास भर में वातित रहे हैं और कोशिकाओं निश्चित संस्कृतियों में, मिलनसार रोगाणुओं एक 14 समुदाय में विकसित करने के लिए बढ़ने की अनुमति दे सकते हैं. वाम बरकरार, माइक्रोबियल समुदायोंअपने स्वयं के सूक्ष्म वातावरण, इथेनॉल जैसे स्रावित विषाक्त पदार्थों, और संभवतः कोशिकाओं के बीच संकेतन ffect. हालांकि, निरंतर पर्याप्त वातन प्राप्त करने के लिए आवश्यक तरल संस्कृतियों का मिश्रण है, कृत्रिम रूप से सूक्ष्म समुदायों और उनके सूक्ष्म वातावरण है जो उनके विकास के मोड को प्रभावित कर सकता है बाधित. पार संदूषण ठोस अगर तरीकों में एक चिंता का कम है के बाद से वहाँ तरल संस्कृतियों के बीच कोशिकाओं को ले जाने की बौछार के लिए कम अवसर है. यदि संदूषण ठोस अगर assays में विदेशी हवा वहन रोगाणुओं द्वारा होता है, यह अक्सर ठोस अगर प्लेटों के दृश्य निरीक्षण से पता लगाया जा सकता है और के लिए जिम्मेदार है या हटा दिया.
QFA throughput के दो मायनों में समानांतर तरल तरीकों की तुलना में काफी अधिक है. सब से पहले, QFA प्लेट (और SGA) पर टीका संस्कृतियों को एक साथ पैक कर रहे हैं अधिक घनी, प्लेट प्रति अधिक स्वतंत्र संस्कृतियों दे रही है. QFA में आम तौर पर कर रहे हैं 308 संस्कृतियों, गैर प्रयोगात्मक धार (चित्रा 1) संस्कृतियों कॉम गिनती नहीं96 या 100 प्रति प्लेट संस्कृतियों के साथ तरल संस्कृतियों समानांतर मुकाबले. दूसरे, QFA प्रयोगों प्लेटों की एक बहुत बड़ी संख्या को बढ़ाया जा सकता है. जबकि एक एकल QFA प्रयोग में विश्लेषण प्लेटों की संख्या केवल एक मशीन या गर्म कमरे, न्यूनतम स्वीकार्य छवि पर कब्जा आवृत्ति और अधिकतम प्राप्त कब्जा आवृत्ति में उपलब्ध स्थान के द्वारा सीमित है, एक तरल विकास प्रयोग में प्लेटों की संख्या दृढ़ता से सीमित है प्लेट पाठक (आमतौर पर एक या दो प्लेट), या प्लेट पाठक (आम तौर पर 25-50 प्लेट) से जुड़ी स्टेकर की क्षमता के द्वारा. हमने हाल ही में 123 प्लेटें, प्रत्येक पर 308 प्रयोगात्मक संस्कृतियों के साथ एक पूरी तरह से स्वचालित QFA प्रयोग किया है, 37,884 युगपत संस्कृतियों दे. अनुमान है कि हम स्वतंत्र तरल में बढ़ती संस्कृतियों की अधिकतम प्राप्त संख्या 96 (संस्कृतियों थाली /) है एक्स (प्लेटें स्टेकर /) 50 +४,८०० =, जो दस हमारे QFA throughput के तुलना में कम गुना के आसपास है. तरल संस्कृति स्क्रीन के लिए एक वैकल्पिक करने के लिए कई स्वचालित gro के उपयोगसमानांतर में wth उपकरणों (8 Blomberg से समीक्षा से तालिका 1), प्रत्येक एक या दो प्लेटों की क्षमता वाले. प्रत्येक डिवाइस में तापमान नियंत्रण स्वतंत्र है, और इसलिए शर्तों समान नहीं हैं, लेकिन यह सोचते हैं कि वे कर रहे हैं, इस वर्कफ़्लो के 190 कम से कम इस तरह के उपकरणों (डिवाइस प्रति 200 तरल संस्कृतियों संभालने) QFA throughput के मैच के लिए की आवश्यकता होगी.
सारांश में, QFA उच्च गुणवत्ता वाले एक कार्यप्रवाह है कि उपयोगी दोनों छोटे पैमाने पर ध्यान केंद्रित प्रयोगों और उच्च throughput स्क्रीन में मात्रात्मक विकास phenotypes इकट्ठा करने के लिए लागू कर सकते हैं. यह काफी लचीला रोबोट उपकरणों के लिए आवश्यकताओं के साथ अलग को प्रभावी ढंग से लागू किया जाना है. QFA वर्कफ़्लो के कम्प्यूटेशनल घटक मुक्त रूप से उपलब्ध है, खुला स्रोत कोड पर आधारित है.
The authors have nothing to disclose.
हम कृतज्ञता हमारी प्रयोगशाला और बूढ़े और समर्थन और उपयोगी विचार – विमर्श के लिए नुट्रीसन (CISBAN) का एकीकृत सिस्टम जीवविज्ञान के लिए केंद्र के सभी सदस्यों को स्वीकार करते हैं. इस अध्ययन में जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी) (BB/C008200/1) और वेलकम ट्रस्ट (075,294, 093,088) के द्वारा समर्थित किया गया.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.