Kvantitativ Fitness Analys (QFA) är en kompletterande serie experimentella och beräkningsmässiga metoder för att skatta mikrobiella kultur fitnesses. QFA beräknar effekten av genetiska mutationer, läkemedel eller andra behandlingar appliceras på mikrob tillväxt. Experiment skalning från fokuserad analys av en enda kultur tusentals parallella kulturer kan utformas.
Kvantitativ Fitness Analys (QFA) är en experimentell och beräkningsvetenskap arbetsflöde för att jämföra fitnesses av mikroorganismkulturer odlade parallellt 1,2,3,4. QFA kan tillämpas på fokuserade observationer av enskilda kulturer men är mest användbar för Genomvid genetiska interaktion eller skärmar läkemedel utreder upp till tusentals oberoende kulturer. Den centrala experimentella metoden är ympning av oberoende, utspädda flytande mikroorganismkulturer på fasta agarplattor som inkuberas och regelbundet fotograferas. Fotografier från varje tidpunkt analyseras, vilket ger kvantitativa uppskattningar celltäthet, som används för att konstruera tillväxtkurvor, vilket tillåter kvantitativ kondition som skall härledas. Kultur fitnesses kan jämföras för att kvantifiera och rangordna genetiska samspel styrkor eller känsligheter läkemedel. Effekten på kulturen lämplighet eventuella behandlingar tillsätts i underlaget agar (t.ex. små molekyler, antibiotika eller näringsämnen) eller appliceras på plattor externly (t.ex. UV-bestrålning, temperatur) kan kvantifieras genom QFA.
Den QFA arbetsflödet producerar tillväxt beräknar analoga med de som erhållits genom spektrofotometrisk mätning av parallella flytande kulturer i 96-brunns-eller 200-brunnars platta läsare. Viktigare är QFA signifikant högre genomströmning jämfört med sådana metoder. QFA kulturer växa på ett fast agar yta och är därför väl luftas under tillväxt utan behov av omrörning eller skakning.
QFA genomströmningen är inte så hög som den hos vissa syntetiska genetiska Array (SGA) screeningmetoder 5,6. Eftersom QFA kulturer kraftigt späds innan de ympas på agar, kan QFA fånga mer kompletta tillväxtkurvor, inklusive exponentiell och faser mättnad 3. Till exempel tillväxtkurva observationer tillåter kultur fördubbling tider uppskattas direkt med hög precision, som diskuterats tidigare 1.
Här presenterar vi enspecifika QFA protokoll tillämpas på tusentals S. cerevisiae kulturer som automatiskt hanteras av robotar under ympning, inkubation och bildhantering. Alla dessa automatiska steg kan ersättas av en likvärdig, manuell procedur med en tillhörande minskning av kapacitet, och vi presenterar en lägre protokoll genomströmning manual. Samma QFA mjukvaruverktyg kan tillämpas på bilder tagna i någon arbetsflöde.
Vi har lång erfarenhet av att tillämpa QFA till kulturer av den spirande jästen S. cerevisiae men vi förväntar oss att QFA kommer att vara lika användbar för att undersöka kulturer fissionsjäst S. pombe och bakteriekulturer.
QFA är i många avseenden en direkt ättling till tre etablerade bänk skala mikrobiologiska tekniker: kultur spädningsserie stickprov 9, tillväxtkurva beslutsamhet i luftade flytande kulturer 9 och replica plating 13. Dessa tre metoder sammanfattas och jämföres med QFA och andra storskaliga metoder i tabell 2. I spädningsserier stickprov definierar en stam lämplighet som dess förmåga att bilda kolonier i en serie av kulturer som odlats från en rad av inokulat spädningar att QFA åtgärder stam kondition genom att upprepade observationer av en enda kultur konstruera en tillväxtkurva. Kvantifiera fitness från enstaka kulturer ger många fler stammar som skall undersökas samtidigt under identiska förhållanden. Replikera matriser av kulturer gör upprepade tester av stam samlingar, mest användbart när man testar för skillnader kultur fitness i olika miljöer eller genetiska bakgrund. Den QFA protokoll presenteradesHär använder dyra robotar utrustning för att kopiera, inokulera, inkubera och bild agarplattor, lämplig för observation tillväxt av tusentals oberoende kulturer (robot QFA, tabell 2). Eftersom QFA bygger på etablerade, traditionella lab tekniker, kan det också göras betydligt billigare genom att ersätta robot hjälp med manuella steg (manuell QFA, tabell 2). Manuell QFA innebär replikation och ympning av kulturer på agarplattor med en manuell PIN-kod verktyg och manuell överföring av plattor till och från en inkubator för fotografering. Samma Beräkningsanalys arbetsflöde kan användas för att generera tillväxtkurvor från antingen experimentell design.
QFA fitness uppskattningar verkar vara förhållandevis exakt. I figur 4, är de genomsnittliga fitnesses av fyra exempel kluster av funktionellt besläktade gendeletioner markeras. Närheten medlemmar i varje funktionellt relaterad gen klass i två oberoendeent genetisk bakgrund (ura3A och CDC13-1) indikerar reproducerbarhet QFA fitness uppskattningar. Till exempel, bara 3 gendeletioner (av möjliga 4300) isolerade de tre medlemmarna i det bevarade MRX komplex.
High-throughput alternativ till QFA för testning tillväxtegenskaperna hos mikrobiella stammar innefattar SGA 5,6, konkurrens skärmar i Streckkodsformulär bibliotek 11,12 och skärmar som fångar optisk densitet kinetik i spektrofotometriska läsare plattan 10 som är sammanfattade i tabell 2 och beskrivs mera fullständigt på annan plats 8 . QFA och SGA plattor, där kulturer växer på fasta Agarytorna (agar metoder, tabell 2) kan hanteras snabbt och enkelt genom robot. Fasta agarytan kulturerna är väl luftas hela tillväxten och celler kan växa i fasta kulturer, så sällskapliga mikrober att växa i ett samhälle 14. Behåll, mikrobiella samhällen enffect egna mikromiljöer, toxiner utsöndrande såsom etanol, och eventuellt signalering mellan celler. Men kontinuerlig blandning av flytande kulturer, som krävs för att uppnå adekvat luftning, konstgjort stör mikrobiella samhällen och deras mikromiljöer som kan påverka deras sätt att tillväxt. Korskontaminering är mindre ett problem i fast agar metoder eftersom det är mindre möjlighet för vätskestänk bär celler mellan kulturer. Om kontaminering sker genom främmande luftburna mikrober i fast agar analyser, kan det ofta detekteras genom visuell inspektion av fasta agarplattor och redovisas eller avlägsnas.
QFA genomströmningen är betydligt högre än för parallella flytande metoder på två sätt. Först av allt om QFA (och SGA) plattor, är ympade kulturerna packas tillsammans tätare, vilket ger flera oberoende kulturer per platta. I QFA finns normalt 308 kulturer, inte räknar icke-experimentella senaste kulturer (figur 1) comfört med parallella flytande kulturer med 96 eller 100 kulturer per platta. För det andra kan QFA experiment skalas till en mycket större antal plattor. Medan antalet plattor analyseras i en enda QFA försöket begränsas endast av det tillgängliga utrymmet i en inkubator eller varmt rum, den minsta tillåtna bildfångst frekvens och högsta uppnåeliga fånga frekvens är antalet plattor i en vätska tillväxt experiment starkt begränsat genom förmågan att plattläsare (typiskt en eller två plattor) eller av den travande fäst vid plattläsare (typiskt 25-50 plattor). Vi har nyligen genomfört en helautomatiserad QFA experiment på 123 plattor, var och en med 308 experimentella kulturer, vilket ger 37,884 samtidiga kulturer. Vi bedömer att maximalt uppnåeliga antal oberoende kulturer som växer i vätskan är 96 (kulturer / platta) x 50 (plattor / Staplare) = 4800, vilket är cirka tio gånger mindre än vår QFA genomströmning. Ett alternativ för flytande kultur skärmar är att använda många automatiserade GROwth enheter parallellt (tabell 1 från granskning av Blomberg 8), vardera med en kapacitet av en eller två plattor. Temperaturreglering i varje enhet är oberoende och därför förhållandena inte är identiska, men förutsatt att de är, skulle detta arbetsflöde kräver minst 190 sådana enheter för att matcha QFA genomströmning (förutsatt 200 flytande kulturer per enhet).
Sammanfattningsvis är QFA en hög kvalitet arbetsflöde som kan med fördel tillämpas för att samla in kvantitativa tillväxt fenotyper i både små inriktade skala experiment och hög kapacitet skärmar. Det är flexibelt nog att kunna tillämpas effektivt med varierande krav på robot utrustning. Den beräkningsmässiga delen av QFA Arbetsflödet är baserat på fritt tillgängliga, öppen källkod.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner tacksamt alla medlemmar i vårt laboratorium och Centrum för integrerad System Biology of Ageing and Nutrition (CISBAN) för stöd och hjälpsamma diskussioner. Denna studie stöddes av bioteknik och Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) och Wellcome Trust (075.294, 093.088).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.