Este artigo descreve a transformação genética da alga marinha unicelular<em> Ostreococcus tauri</em> Por eletroporação. Este organismo eucariótico é uma plataforma de modelo eficaz para plantas superiores, possesing muito reduzida complexidade genômica e celular e de ser facilmente passíveis de ambos cultura de células e biologia química.
Os problemas mais comuns que impedem um progresso rápido em Ciências da planta incluem tecido, celulares e complexidade organismo como um todo e, nomeadamente, o elevado nível de redundância genética genômica afetando simples em plantas superiores. O novo modelo organismo Ostreococcus tauri é o menor eucariota de vida livre conhecido até à data, e possui um tamanho de genoma grandemente reduzida e 1,2 complexidade celular, que se manifesta-se pela presença de apenas uma da maioria dos organelos (mitocôndria, cloroplasto, pilha de Golgi) por celular, e um genoma que contém apenas ~ 8000 genes. Além disso, a combinação de unicellularity e cultura fácil proporciona uma plataforma passível de abordagens em biologia químicos. Recentemente, Ostreococcus tem sido empregada com sucesso para estudar mecanismos básicos subjacentes cronometragem circadiano 3-6. Os resultados deste organismo modelo ter afetado não só a ciência das plantas, mas também a biologia dos mamíferos 7. Este exemplo evidencia como a experimentação rápida em umeucarioto simples da linhagem verde pode acelerar a pesquisa em organismos mais complexos, gerando hipóteses testáveis utilizando métodos tecnicamente viáveis apenas neste fundo de menor complexidade. Conhecimento de um genoma ea possibilidade de modificar genes são ferramentas essenciais em qualquer espécie de modelo. Genomic 1, transcriptomic 8, 9 e informação Proteômica para esta espécie está livremente disponível, ao passo que os métodos anteriormente relatados 6,10 para transformar geneticamente Ostreococcus são conhecidos por poucos laboratórios em todo o mundo.
Neste artigo, os métodos experimentais para transformar geneticamente este organismo novo modelo com uma sobre-expressão de construção através de electroporação são descritas em detalhe, bem como o método de inclusão de células transformadas em baixo percentagem de agarose para permitir a selecção de linhas transformadas provenientes de uma único transformado da célula. Após o sucesso da aplicação OstreocoCCUs para pesquisa circadiano, o interesse crescente em Ostreococcus pode ser esperado de diversas áreas de pesquisa dentro e fora das ciências vegetais, incluindo áreas biotecnológicas. Pesquisadores de uma ampla gama de ciências biológicas e médicas que trabalham em conservadas vias bioquímicas podem considerar a investigação prossegue em Ostreococcus, livre da complexidade genômica e organismal de espécies de maior porte do modelo.
Axeny estado e cultura celular é de importância crucial para o processo de transformação. Embora as células são normalmente mantida em ciclos de 12 horas de luz, 12 horas escuro, a eficiência da transformação nas células cultivadas sob estas condições foram encontrados para ser insuficiente. Durante os repetidos granulação / ressuspensão etapas, as células devem sempre ressuspender facilmente. Se as células agregado, ou uma substância muco-como é presente, é melhor para iniciar o processo desde o início novamente. Tipicamente, ~ 50 colónias pode ser esperado em cada placa de transformação, versus nenhum sobre a placa de controlo negativo. No caso de baixa eficiência de transformação, as condições de cultura deve ser variada para assegurar células estão no estado ideal. As variáveis que afectam a eficiência de transformação incluem a temperatura ambiente no laboratório (deve estar próxima de 20 ° C) e velocidade de manipulação (Processo de granulação células [2,3] para recuperação [2,7] deve tomar ~ 1 hora). É também importante que todas as soluções de umre feito fresco antes de cada transformação. Para inclusão em placas, a concentração de LMP de agarose é crucial. Células Ostreococcus não crescerão em concentrações elevadas de agarose, e irá difundir em baixas concentrações.
Três vetores de transformação para Ostreococcus foram publicados anteriormente 6, e mais vetores devem ser gerados e publicados em breve. O vector existente Pot-Luc 6 permite a utilização de um promotor de escolha, em combinação com uma etiqueta de pirilampo C-terminal da luciferase permitindo a selecção de linhas transgénicas mais rápida, mais padrões de expressão tratáveis, enquanto que o vector Potox 6 transporta o forte promotor indutível 13 tirada da Ostreococcus Fosfato de alta afinidade gene transportador (HAPT) para sobre-expressão de gene de interesse. O vector Potox-Luc deriva Potox, transportando um marcador de luciferase adicional que pode ser utilizada para a selecção de linhas indirecta superexpressão <saté> 14. Marcadores de seleção de sucesso sobre esses vetores são Nourseothricin e G148. No entanto, as células Ostreococcus são altamente resistentes a vários antibióticos, e as concentrações de compostos necessários para a selecção de células transgénicas Ostreococcus é maior do que para os sistemas de modelo convencional (2 mg / ml).
Embora o processo parece ineficiente, o grande número de células e ADN de plasmídeo necessária para este procedimento não representa qualquer obstáculo significativo. Um maior limitação é que cada linha gerada, que é resistente ao marcador seleccionável precisa de ser analisadas individualmente para verificar que a construção inteira está integrado no DNA. Observamos exemplos em que a expressão bem sucedida do marcador seleccionável não correspondiam a inserção do gene de interesse real; integrações ie parciais podem ocorrer. Evidentemente, a inserção aleatória no genoma também significa que não existe controlo do local de inserção utilizando este método, e métodos bom base na recombinação homóloga estão sendo desenvolvidos atualmente. No entanto, o método aqui descrito é, para o nosso melhor conhecimento, actualmente o único método caracterizado para gerar células Ostreococcus geneticamente modificados.
Como Ostreococcus tauri só recentemente foi usado como um organismo modelo experimental, a maioria dos métodos de trabalho com essas células é susceptível de evoluir e ser refinado pela comunidade de pesquisa em crescimento envolvidos. Este protocolo destina-se a ajudar as pessoas a iniciar os trabalhos com Ostreococcus, mas nem por isso pretende descrever tudo o que há para saber sobre a transformação genômico da microalga. A confiança autores que os leitores serão capazes de se adaptar este protocolo para suas próprias necessidades como pequenas diferenças em incubadoras (níveis de luz ou de qualidade) e os outros parâmetros existentes e provavelmente terá de ser otimizado em cada laboratório individual para obter as culturas saudáveis necessários para este protocolo. Depois de dominar as técnicas descritas aqui,vectores podem ser construídos para gerar luminescente, fluorescente, ou outras linhas de fusão etiquetados sob o controlo de uma variedade de promotores. Esta plataforma experimental emocionante novela será útil para estudar como os complexos problemas bioquímicos são resolvidos em um eucarionte de complexidade reduzida, em que abordagens farmacológicas são altamente facilitada 3.
The authors have nothing to disclose.
SynthSys um Centro para Biologia de Sistemas Integrativa financiado pelo BBSRC e adjudicação EPSRC D019621. UE Rede de Excelência FP6 "Genomics Marinhos" bolsa para FYB financiou o desenvolvimento de métodos de transformação genética.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |