Cet article décrit la transformation génétique de l'algue marine unicellulaire<em> Ostreococcus tauri</em> Par électroporation. Cet organisme eucaryote est une plate-forme modèle efficace pour les plantes supérieures, possesing considérablement réduit la complexité génomique et cellulaire et à être prête à la culture cellulaire et biologie chimique.
Les problèmes courants qui empêchent des progrès rapides en sciences de plantes comprennent les cellules, des tissus et de la complexité organisme entier, et notamment le niveau élevé de redondance génomique touchant la génétique simples chez les plantes supérieures. Le roman organisme modèle Ostreococcus tauri est le plus petit eucaryote libre-vivant connu à ce jour, et possède une taille de génome très réduit et 1,2 complexité cellulaire, qui se manifeste par la présence d'un seul de la plupart des organites (mitochondrie, chloroplaste, pile de Golgi) par cellulaire, et un génome contenant seulement de ~ 8000 gènes. En outre, la combinaison de unicellularity et de la culture facile fournit une plate-forme se prête à des approches de biologie chimique. Récemment, Ostreococcus a été employée avec succès pour étudier les mécanismes sous-jacents de base chronométrage circadien 3-6. Les résultats de cet organisme modèle ont eu un impact non seulement la science des plantes, mais aussi la biologie des mammifères 7. Cet exemple met en évidence comment l'expérimentation rapide dans uneucaryote simple à partir de la lignée verte peut accélérer la recherche dans les organismes plus complexes en générant des hypothèses testables en utilisant des méthodes techniquement réalisables que dans ce contexte de complexité réduite. Connaissance d'un génome et la possibilité de modifier les gènes sont des outils essentiels dans toutes les espèces modèles. Génomique 1, transcriptomique 8, 9 et protéomique des informations de cette espèce est disponible gratuitement, alors que les méthodes précédemment rapportés à 6,10 génétiquement transformer Ostreococcus sont connus pour quelques laboratoires à travers le monde.
Dans cet article, les méthodes expérimentales pour transformer génétiquement cet organisme nouveau modèle à une surexpression de construire au moyen de l'électroporation sont décrites en détail, ainsi que la méthode de l'inclusion des cellules transformées en pourcentage d'agarose à bas pour permettre la sélection de lignées transformées provenant d'une seule cellule transformée. Suite à l'application réussie de OstreocoCCU à la recherche du rythme circadien, un intérêt croissant pour Ostreococcus On peut s'attendre à des domaines de recherche différents dans et en dehors des sciences végétales, y compris les zones biotechnologiques. Les chercheurs d'un large éventail de sciences biologiques et médicales qui travaillent sur les voies biochimiques conservés peut considérer la recherche poursuit dans Ostreococcus, exempt de la complexité génomique et organismique d'espèces modèles plus grands.
Cellulaire axeny Etat et de la culture est d'une importance cruciale pour la procédure de transformation. Bien que les cellules sont généralement maintenus en cycles de 12 heures de lumière, 12 heures sombres, l'efficacité de transformation dans les cellules cultivées dans ces conditions ont été jugées insuffisantes. Au cours des répétées de granulation / remise en suspension des mesures, les cellules doivent toujours remettre en suspension facilement. Si globale cellules, ou d'une substance comme le mucus est présent, il est préférable de commencer la procédure depuis le début. En règle générale, environ 50 colonies on peut s'attendre sur chaque plaque de transformation, par opposition à aucune sur la plaque de contrôle négatif. En cas de faible efficacité de transformation, des conditions de culture doit être modifiée afin d'assurer cellules sont dans l'état optimal. Les variables qui affectent l'efficacité de transformation comprennent la température ambiante dans le laboratoire (qui devrait être proche de 20 ° C) et la vitesse de traitement (la procédure de centrifugation des cellules [2.3] à la reprise [2,7] devrait prendre environ 1 heure). Il est également important que toutes les solutions d'unre fait frais avant chaque transformation. Pour être inclus dans des plaques, la concentration de agarose LMP est crucial. Cellules Ostreococcus ne poussent pas dans des concentrations élevées d'agarose, et se diffuse dans de faibles concentrations.
Trois vecteurs de transformation pour Ostreococcus ont déjà été publiés 6, et plus de vecteurs devraient être générées et publiées sous peu. Le vecteur existant Pot-Luc 6 permet l'utilisation d'un promoteur de choix en combinaison avec une étiquette de luciole luciférase C-terminale permettant la sélection de ligne plus rapide transgénique plus motifs d'expression traitables, que le vecteur porte la Potox 6 inductible fort 13 promoteur de la prise Ostreococcus Haut Phosphate Transporter Affinity (HAPT) gène de la surexpression du gène d'intérêt. Le vecteur Potox-Luc dérive de Potox, portant un marqueur luciférase supplémentaire qui peut être utilisé pour la sélection indirecte de lignes surexpression <sjusqu'à> 14. Marqueurs de sélection retenus sur ces vecteurs sont nourseothricine et G148. Cependant, les cellules Ostreococcus sont très résistantes à de nombreux antibiotiques, et les concentrations de composés nécessaires pour la sélection des cellules transgéniques Ostreococcus est plus élevé que pour les systèmes de modèle classique (2 mg / ml).
Bien que le processus semble inefficace, le grand nombre de cellules et l'ADN plasmidique nécessaire pour cette procédure ne pose aucun obstacle significatif. Un plus grand limitation est que chaque ligne générée qui est résistant à l'marqueur sélectionnable doit être analysés individuellement pour vérifier que la construction entière est intégré dans l'ADN. Nous avons observé des exemples dans lesquels l'expression réussie du marqueur de sélection ne correspondent pas à l'insertion du gène d'intérêt réel; intégrations partielles peuvent se produire soit. De toute évidence, l'insertion au hasard dans le génome signifie également qu'il n'y a pas de contrôle du site d'insertion en utilisant cette méthode, et les méthodes de basé sur la recombinaison homologue sont actuellement en cours d'élaboration. Cependant, la méthode décrite ici est, à notre connaissance, actuellement la seule méthode pour générer des cellules caractérisée Ostreococcus génétiquement modifiés.
Comme Ostreococcus tauri a récemment été utilisé comme un organisme modèle expérimental, la plupart des méthodes de travail avec ces cellules est susceptible d'évoluer et d'être affiné par la communauté de recherche de plus en plus impliqués. Ce protocole est destiné à aider les gens à entreprendre des travaux avec Ostreococcus, mais ne prétend nullement à décrire tout ce qu'il ya à savoir sur la transformation de la génomique cette microalgue. La confiance auteurs que les lecteurs seront en mesure d'adapter ce protocole à leurs propres besoins que de petites différences dans les incubateurs (niveaux de luminosité ou de qualité) et d'autres paramètres seront présentes et sans doute être optimisé dans tous les laboratoires individu d'obtenir des cultures saines nécessaires à cette protocole. Après avoir maîtrisé les techniques décrites ici,vecteurs peut être construit pour générer luminescente, fluorescente ou d'autres lignes de fusion étiquette sous le contrôle d'une série de promoteurs. Cette plate-forme expérimentale roman passionnant sera utile d'étudier comment les problèmes complexes biochimiques sont résolus dans un eucaryote de réduction de la complexité, dans laquelle les approches pharmacologiques sont hautement facilitées 3.
The authors have nothing to disclose.
SynthSys un Centre de biologie intégrative des systèmes financés par le BBSRC et d'attribution EPSRC D019621. EU FP6 réseau d'excellence "Marine Genomics" subvention à FYB a financé le développement de méthodes de transformation génétique.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |