Denna artikel beskriver genetisk omvandling av encelliga marina algen<em> Ostreococcus Tauri</em> Genom elektroporation. Detta eukaryot organism är en effektiv modell plattform för högre växter, possesing kraftigt reducerad genomisk och cellulär komplexitet och är lätt mottaglig för både cellkultur och kemisk biologi.
Vanliga problem som hindrar snabba framsteg i växtforskning omfattar cell-, vävnads-och hela organismen komplexitet, och i synnerhet den höga genomisk redundans påverkar enkla genetik i högre växter. Den nya modellen organismen Ostreococcus Tauri är den minsta fritt levande eukaryot känt hittills, och har en kraftigt reducerad genomstorlek och cellulära komplexitet 1,2, manifesteras genom närvaron av en enda av de flesta organeller (mitokondrien, kloroplast, Golgi stack) per cellen, och en genom som innehåller endast ~~~HEAD=NNS 8000 gener. Vidare ger kombinationen av unicellularity och enkelt kulturen en plattform mottaglig för strategier Chemical Biology. Nyligen har Ostreococcus framgångsrikt använts för att studera mekanismerna som ligger till grund cirkadiska tidtagning 3-6. Resultat från denna modell organism har påverkat inte bara Plant Science, men också däggdjursbiologi 7. Detta exempel belyser hur snabbt experiment i enenkelt eukaryot från den gröna linjen kan accelerera forskningen i mer komplexa organismer genom att generera testbara hypoteser med hjälp av metoder tekniskt genomförbara bara denna bakgrund av minskad komplexitet. Kunskap om ett genom och möjligheten att ändra gener är viktiga verktyg i alla modeller arter. Genomic 1, Transcriptomic 8 och proteomik 9 för den här arten är fritt tillgänglig, medan de tidigare rapporterade metoder 6,10 genetiskt omvandla Ostreococcus är kända för att få laboratorier över hela världen.
I den här artikeln, de experimentella metoder omvandla genetiskt denna roman modellen organism med ett överuttryck konstruktion med hjälp av elektroporation beskrivs i detalj, liksom metoden för införandet av transformerade celler i låg procent agaros för att möjliggöra selektion av transformerade linjer som härrör från en enda transformerad cell. Efter en framgångsrik tillämpning av OstreocoCCU till dygnsrytm forskning kan växande intresse för Ostreococcus kan förväntas av olika forskningsområden inom och utanför växtforskning, inklusive biotekniska områden. Forskare från ett brett spektrum av biologiska och medicinska vetenskaper som arbetar på bevarade biokemiska vägar kan överväga att bedriva forskning inom Ostreococcus, fri från genomiska och organismbiologi komplexitet större modell arter.
Cellular staten och kultur axeny är av avgörande betydelse för omvandlingen förfarandet. Även celler upprätthålles vanligen i cykler om 12 timmar ljus, var 12 h mörker, transformationseffektiviteten i celler som odlats under dessa betingelser visade sig vara otillräckliga. Under de upprepade pelletering / resuspension steg bör cellerna återsuspendera alltid lätt. Om celler tillsammans, eller en slem-liknande substansen är närvarande är det bättre att börja proceduren från början igen. Normalt kan cirka 50 kolonier kan förväntas på varje transformation plattan, jämfört ingen på den negativa kontrollen plattan. Vid låg transformationseffektivitet bör odlingsbetingelser kan varieras för att säkerställa cellerna är i optimalt tillstånd. Variabler som påverkar transformationseffektivitet inkluderar omgivande temperaturen i laboratoriet (bör vara nära 20 ° C) och hantering hastighet (proceduren från pelletering celler [2,3] till återhämtning [2,7] bör ta ~ 1 timme). Det är också viktigt att alla lösningar enRe gjorde färska före varje transformation. För införande i plattor, är koncentrationen av LMP-agaros avgörande. Ostreococcus celler kommer inte att växa i höga koncentrationer agaros, och kommer att diffundera i låga koncentrationer.
Tre transformationsvektorer för Ostreococcus har publicerats tidigare 6, och fler vektorer förväntas genereras och publiceras inom kort. Den existerande vektorn Pot-Luc 6 tillåter användningen av en promotor som väljs i kombination med en C-terminal eldflugeluciferas tagg tillåta snabbare transgen linjeval plus hanterlig mönster expressionsvektorer, medan Potox vektorn 6 bär starkt inducerbara promotom 13 tas från den Ostreococcus hög affinitet Fosfat Transportör (HAPT)-genen för överexpression av genen av intresse. Den Potox-Luc vektor härstammar från Potox, som bär en ytterligare luciferas markör som kan användas för indirekt val av överuttryck linjer <sup> 14. Framgångsrika selektionsmarkörer på dessa vektorer är Nourseothricin och G148. Emellertid Ostreococcus celler är mycket resistent mot många antibiotika, och koncentrationerna av föreningar som är nödvändiga för selektion av transgena Ostreococcus celler är högre än för konventionella modellsystem (2 mg / ml).
Även om processen visas ineffektiv, utgör det stora antalet celler och plasmid-DNA som behövs för detta förfarande ingen signifikant hinder. En större begränsning är att varje genererad linje som är resistent mot den selekterbara markören måste analyseras individuellt för att kontrollera att hela konstruktionen är integrerad i DNA. Vi har observerat exempel där lyckade uttryck av den valbara markören inte motsvarar införandet av den faktiska genen av intresse, det vill säga partiella integrationer kan förekomma. Uppenbarligen innebär slumpmässig insättning i genomet också att det inte finns någon kontroll av införingsstället användning av denna metod, och metoder bföljer ofta önskemål om homolog rekombination för närvarande utvecklas. Men beskrivs metoden här är, såvitt vi vet, för närvarande den enda kännetecknas metoden för att skapa genetiskt modifierade Ostreococcus celler.
Som Ostreococcus Tauri har först nyligen använts som en experimentell modell organism, är de flesta metoder som arbetar med dessa celler kan utvecklas och förfinas av den växande inblandade forskarsamhället. Detta protokoll är tänkt att hjälpa människor påbörja arbetet med Ostreococcus, men på något sätt anspråk på att beskriva allt som finns att veta om genomisk omvandling av denna mikroalg. Författarna förtroende som läsare kommer att kunna anpassa detta protokoll till sina egna behov som små skillnader i kuvöser (ljusnivåer eller kvalitet) och andra parametrar kommer att finnas och sannolikt måste optimeras i varje enskilt laboratorium för att få de friska kulturerna som behövs för detta protokoll. Efter bemästra de tekniker som beskrivs här,vektorer kan konstrueras för att generera lysande, fluorescerande eller andra taggade linjer fusion under kontroll av en rad promotorer. Denna spännande nya experimentell plattform kommer att vara användbart att studera hur komplicerade biokemiska problem löses i en eukaryot av minskad komplexitet, där farmakologiska metoder är mycket underlättas 3.
The authors have nothing to disclose.
SynthSys ett centrum för integrativ systembiologi finansieras av BBSRC och EPSRC utmärkelse D019621. EU FP6 Network of Excellence "marina Genomics" bidrag till FYB har finansierat utvecklingen av genetisk transformation metoder.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |