Bu makalede, tek hücreli deniz alg genetik dönüşümü anlatılmaktadır<em> Ostreococcus tauri</em> Elektroporasyonla. Bu ökaryot organizma büyük ölçüde azaltılmış genomik ve hücresel karmaşıklığı haiz ve hücre kültürü ve kimyasal biyoloji hem de kolayca uysal biri, yüksek bitkiler için etkili bir model platformdur.
Bitki Bilimleri hızlı ilerleme engelleyen ortak sorunları hücresel, doku ve tüm organizmanın karmaşıklığı ve yüksek bitkiler basit genetik etkileyen genomik fazlalık özellikle yüksek düzeyde bulunmaktadır. Yeni model organizma Ostreococcus tauri bugüne kadar bilinen en küçük serbest yaşayan ökaryot ve başına en organellerin sadece biri (mitokondri, kloroplast, golgi yığını) varlığı ile kendini gösteren büyük oranda azaltılmış genom büyüklüğü ve hücresel karmaşıklık 1,2, sahip Hücre ve sadece ~ 8.000 gen içeren bir genomu. Dahası, unicellularity ve kolay bir kültür kombinasyonu kimyasal biyolojisi yaklaşımlara müsait bir platform sağlar. Son zamanlarda, Ostreococcus başarıyla sirkadiyen Timekeeping 3-6 altında yatan temel mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Bu model organizma sonuçları memeli biyoloji 7 bitki bilimi sadece etkiledi, ama var. Bu örnek, nasıl hızlı bir deney vurgulamaktadıryeşil soydan basit ökaryot yalnızca sınırlı karmaşıklığı bu arka planda teknik olarak uygulanabilir yöntemlerle sınanabilir hipotezler üretme, daha kompleks organizmalarda araştırma hızlandırabilir. Bir genom ve genler değiştirmek olanağı Bilgi herhangi bir model türler için temel araçlardır. Genetik Ostreococcus dönüştürmek için daha önce bildirilen yöntemler 6,10 dünyada çok az laboratuar bilinmektedir ise Genomik 1, Transkriptomik 8, ve bu türler için Proteomik 9 bilgiler, özgürce kullanılabilir.
Bu makale, deney yöntemleri genetik elektroporasyon yoluyla yapı ayrıntılı olarak belirtildiği gibi dönüştürülmüştür hatları seçimi, bir kaynaklanan izin verecek şekilde düşük oranda agaroz in transforme hücreler dahil edilmesi metodu olan bir aşırı ekspresyonu ile Bu yeni model organizma dönüştürmeye tek hücre dönüştürdü. Ostreoco başarılı uygulama sonrasındasirkadiyen araştırma ccus, Ostreococcus artan bir ilgi biyoteknolojik alanlarda dahil olmak üzere bitki bilimleri, içinde ve dışında çeşitli araştırma alanları beklenebilir. Korunmuş biyokimyasal yollar üzerinde çalışmak biyoloji ve tıp bilimleri, geniş bir alanda araştırmacılar büyük bir model türlerinin genomik ve organizma karmaşıklığı ücretsiz Ostreococcus içinde takip araştırma, düşünebilirsiniz.
Hücresel devlet ve kültür axeny dönüşüm prosedürü için büyük önem taşır. Hücreleri, genellikle ışık 12 saat çevrimi içinde muhafaza edilmesine rağmen, 12 saat karanlık, bu şartlar altında yetiştirilen hücrelerinde dönüşümünün verim yetersiz olduğu bulunmuştur. Tekrarlanan peletleme / tabanda adımları sırasında hücreler her zaman kolaylıkla tekrar süspansiyon gerekir. Hücreleri agrega veya mukus benzeri bir madde varsa, tekrar baştan prosedürü başlatmak için daha iyidir. Tipik olarak, ~ 50 koloniler negatif kontrol plaka üzerinde hiç karşı, her dönüşüm plaka beklenebilir. Düşük dönüşümü verim durumda, kültürleme koşulları hücreleri optimum halindedir sağlamak üzere değiştirilebilir olmalıdır. Dönüşüm verimliliği etkileyen değişkenler ortam laboratuarında sıcaklıkta (yaklaşık 20 ° C olmalı) ve işleme hızı (hücre [2,3] kurtarma [2,7] peletleme gelen Prosedürü ~ 1 saat sürer) içerir. Aynı zamanda önemli olduğu bütün solüsyonlar,yeniden her dönüşüm öncesi taze yaptı. Plakalar dahil olmak için LMP agaroz konsantrasyonu Ostreococcus hücreleri yüksek agaroz konsantrasyonlarda büyümek olmaz. Çok önemlidir ve düşük konsantrasyonlarda karışacaktır.
Ostreococcus için üç dönüşüm vektörleri daha önce 6 yayınlanmış olan ve daha vektörler oluşturulan ve kısa zamanda yayınlanacaktır bekleniyor. Potox vektör 6 Ostreococcus alınan güçlü uyarılabilir 13 promotor taşıyan ise mevcut vektör Pot-Luc 6, hızlı transgenik hat seçimini artı uysal ekspresyonu sağlayan bir C-terminal ateşböceği lusiferaz etiketi ile birlikte bir seçim promotor kullanılmasına izin verir ilgi genin ekspresyonu için yüksek afinite Fosfat Taşıyıcı (HAPT) geni. Potox-Luc vektör aşırı hatları dolaylı seçimi için kullanılabilecek ek bir lusiferaz işareti taşıyan, Potox türemiştir <s14> kadar. Bu vektörler başarılı seçim işaretleyicilerini Nourseothricin ve G148 vardır. Bununla birlikte, birçok Ostreococcus hücreleri antibiyotikler dayanımı ve transjenik Ostreococcus hücrelerin seçilmesi için gerekli olan bileşiklerin konsantrasyonları konvansiyonel sistemlerin modeli (2 mg / ml) daha yüksektir.
Süreci verimsiz görünür rağmen, hücreler ve bu işlem için gerekli plazmid DNA sayıda anlamlı bir engel teşkil etmektedir. Daha geniş bir sınırlama seçilebilir işaretleyici dayanıklı üretilen her satırı tüm yapı DNA entegre olduğunu kontrol etmek için ayrı ayrı analiz edilmesi gerekiyor. Biz seçilebilir marker başarılı ifadesi ilgi gerçek geninin ekleme uymadı hangi örnekler gözlemledim, yani kısmi entegrasyonlar oluşabilir. Açıkça, genom içine rastgele yerleştirilmesi de bu yöntemle ekleme sitenin hiçbir kontrolü olmadığı anlamına gelir, ve yöntemleri bhomolog rekombinasyon üzerine ased halen geliştirilmektedir. Ancak, yöntem, en iyi bilgi için, burada genetiği değiştirilmiş Ostreococcus hücreleri oluşturmak için şu anda sadece karakterize yöntemi açıklanmıştır.
Ostreococcus tauri ancak son zamanlarda bir deneysel model organizma olarak kullanılan olduğu gibi, bu hücrelerin çalışma yöntemleri çoğu gelişmeye ve ilgili artan araştırma topluluğu tarafından rafine edilmesi muhtemeldir. Bu protokol insanların Ostreococcus ile çalışma başlatmak yardımcı olmak için tasarlanmıştır, ama hiçbir şekilde bu mikroalgi genomik dönüşümü hakkında bilmek olduğunu tüm tanımlamak için iddia edilir. Okuyucuları, küçük kuluçka farklılıklar (ışık seviyesi ve kalitesi) ve diğer parametreler var olacaktır olarak kendi ihtiyaçlarına göre bu protokol uyum ve muhtemelen bunun için gerekli sağlıklı kültürleri elde etmek için her bireyin laboratuvarda optimize edilmiş olması mümkün olacak yazarlar güven protokolü. Mastering sonra teknikleri, burada açıklananvektörler promotörleri bir dizi kontrolü altında ışıldayan, floresan veya diğer tagged füzyon hatları oluşturmak için inşa edilebilir. Bu heyecan verici yeni deney platformu karmaşık biyokimyasal sorunlar farmakolojik yaklaşımlar oldukça kolaylaştırdı 3 edildiği azaltılmış karmaşıklığı, bir ökaryot çözülüyor, nasıl çalışmak faydalı olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
BBSRC ve EPSRC ödül D019621 tarafından finanse Bütünleştirici Sistem Biyolojisi için Merkezi SynthSys. FYB için Mükemmellik "Deniz Genomics" hibe AB 6. ÇP Ağ genetik transformasyon yöntemlerinin geliştirilmesi finanse etmiştir.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |