Denne artikel beskriver genetisk transformation af unicellulær marine alger<em> Ostreococcus Tauri</em> Ved hjælp af elektroporation. Dette eukaryot organisme er en effektiv model platform for højerestående planter, possesing stærkt reduceret genomisk og cellulær kompleksitet og er let kan både cellekultur og kemisk biologi.
Almindelige problemer hindrer hurtige fremskridt i Plant Sciences omfatter celle, væv og hele organismen kompleksitet, og især det høje niveau af genomisk redundans påvirker simple genetik i højere planter. Den hidtil ukendte modelorganisme Ostreococcus Tauri er den mindste fritlevende eukaryot kendt til dato, og har en stærkt reduceret genomstørrelse og cellulær kompleksitet 1,2, manifesteret ved tilstedeværelsen af kun et af de fleste organeller (mitokondrier chloroplast, Golgi stabel) pr celle, og et genom, der kun indeholder ~~~HEAD=NNS 8000 gener. Endvidere, at kombinationen af unicellularity og let kultur tilvejebringer en platform egnet til kemiske biologi fremgangsmåder. For nylig er Ostreococcus held blevet anvendt til at undersøge de grundlæggende mekanismer bag cirkadiske tidtagning 3-6. Resultater fra denne model organisme har påvirket ikke kun Plant Science, men også pattedyr biologi 7. Dette eksempel belyser, hvordan hurtige eksperimenter påsimple eukaryote fra den grønne linie kan accelerere forskning i mere komplekse organismer ved at generere testbare hypoteser ved hjælp af metoder, det er teknisk muligt kun på denne baggrund af reduceret kompleksitet. Kendskab til et genom og mulighed for at ændre gener er vigtige redskaber i enhver model arter. Genomisk 1, transkriptom 8, og proteom 9 oplysninger om denne art er frit tilgængelige, mens de tidligere rapporterede metoder 6,10 til genetisk omdanne Ostreococcus er kendt for at få laboratorier verden over.
I denne artikel, at de eksperimentelle fremgangsmåder genetisk transformation denne hidtil ukendte model organisme med en overekspression konstruktion ved hjælp af elektroporering som beskrevet i detaljer, samt fremgangsmåden til optagelse af transformerede celler i lav procentdel agarose for at tillade selektion af transformerede linier stammer fra en enkelt transformeret celle. Efter den vellykkede anvendelse af OstreocoCCUS til circadian forskning, kan stigende interesse i Ostreococcus kan forventes fra forskellige forskningsområder inden for og uden plante videnskaber, herunder bioteknologiske områder. Forskere fra en bred vifte af biologiske og medicinske videnskaber, der arbejder på bevarede biokemiske veje kan overveje at videreføre forskning i Ostreococcus, fri fra genomiske og organismal kompleksiteten af større model arter.
Cellulær stat og kultur axeny er af afgørende betydning for proceduren for transformation. Selvom celler normalt holdes i cyklusser på 12 timers lys og blev 12 timer mørke, transformationseffektivitet i celler dyrket under disse betingelser viser sig at være utilstrækkelige. I løbet af de gentagne foderpelleteringsforhold / resuspension trin, bør celler altid opblandingen nemt. Hvis celler aggregat eller en slim-lignende stof er til stede, er det bedre at starte proceduren fra begyndelsen igen. Typisk kan ~ 50 kolonier forventes på hver transformation plade, versus ingen på den negative kontrol pladen. I tilfælde af lav transformationseffektivitet, bør dyrkningsbetingelser varieres for at sikre cellerne er i den optimale tilstand. Variabler, der påvirker transformationseffektivitet inkludere omgivende temperatur i laboratoriet (bør være tæt på 20 ° C) og håndtering af hastighed (Procedure fra pelletering cellerne [2,3] til nyttiggørelse [2,7] bør tage ~ 1 time). Det er også vigtigt, at alle opløsninger enre lavet frisk før hver transformation. Optages i plader, er koncentrationen af LMP-agarose afgørende. Ostreococcus celler vil ikke vokse i høje agarose koncentrationer og vil diffundere i lave koncentrationer.
Tre transformationsvektorer for Ostreococcus er blevet offentliggjort tidligere 6, og flere vektorer forventes at blive genereret og offentliggjort inden længe. Den eksisterende vektor Pot-Luc 6 tillader anvendelsen af en promotor valg i kombination med et C-terminalt ildflueluciferase tag tillader hurtigere transgene linjevalg plus medgørlige ekspressionsmønstre, hvorimod Potox vektoren 6 bærer en stærk inducerbar promotor 13 tages fra Ostreococcus høj affinitet Phosphate Transporter (HAPT)-genet for overekspression af genet af interesse. Den Potox-Luc vektoren stammer fra Potox, der bærer en yderligere luciferase markør, der kan anvendes til indirekte selektion af overekspression linier <sop> 14. Succesfulde vælgemærkerne på disse vektorer er nourseothricin og G148. Imidlertid Ostreococcus celler er meget resistente over for mange antibiotika, og koncentrationerne af forbindelserne, der er nødvendige for selektion af transgene Ostreococcus celler er højere end for konventionelle modelsystemer (2 mg / ml).
Selv om processen synes ineffektiv, det store antal celler og plasmid-DNA er nødvendig for denne fremgangsmåde udgør nogen væsentlig hindring. En større begrænsning er, at hver genereret linje, der er resistent over for den selekterbare markør skal analyseres individuelt til at kontrollere, at hele konstruktionen er integreret i DNA. Vi har observeret eksempler, i hvilke vellykket ekspression af den selekterbare markør ikke svarer til indsættelse af selve genet af interesse; dvs partielle integrationer kan forekomme. Åbenbart tilfældig insertion i genomet betyder også, at der ikke er nogen styring af indsættelsesstedet anvendelse af denne metode, og fremgangsmåder based på homolog rekombination er i øjeblikket ved at blive udviklet. Men den metode, der er beskrevet her, er, at vores bedste viden, der i øjeblikket er den eneste karakteriseret metode til at generere genetisk modificerede Ostreococcus celler.
Som Ostreococcus Tauri er først for nylig blevet brugt som en eksperimentel model organisme, de fleste metoder arbejder med disse celler vil sandsynligvis udvikle sig og blive forbedret af stigende forskningsmæssig involverede samfund. Denne protokol har til formål at hjælpe folk indlede arbejdet med Ostreococcus, men på ingen måde hævder at beskrive alt, hvad der er at vide om genomisk transformation af denne microalga. Forfatterne tillid til, at læserne vil være i stand til at tilpasse denne protokol til deres egne behov, som små forskelle i inkubatorer (lysniveauer eller kvalitet) og andre parametre vil eksistere, og sandsynligvis skal optimeres i hvert enkelt laboratorium for at få de sunde kulturer er nødvendige for denne protokol. Efter at have læst de teknikker, der er beskrevet her,vektorer kan konstrueres til at generere luminescerende, fluorescerende eller andre mærkede fusionsproteiner linier under kontrol af en række promotorer. Denne spændende roman eksperimentel platform vil være nyttigt at undersøge, hvordan komplicerede biokemiske problemer løses i en eukaryot af reduceret kompleksitet, hvor farmakologiske tilgange er meget lettere 3.
The authors have nothing to disclose.
SynthSys et Center for Integrativ Systembiologi finansieret af BBSRC og EPSRC pris D019621. EU FP6 Network of Excellence "Marine Genomics" tilskud til FYB har finansieret udviklingen af genetisk transformation metoder.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |