Dit artikel beschrijft genetische transformatie van de eencellige mariene algen<em> Ostreococcus Tauri</em> Door elektroporatie. Dit eukaryote organisme is een effectief model platform voor hogere planten, het bezitten van veel minder genomische en cellulaire complexiteit en zijn gemakkelijk vatbaar is voor zowel de celkweek en chemische biologie.
Veel voorkomende problemen belemmeren een snelle vooruitgang in de Plant Sciences zijn cellulair, weefsel en hele organisme complexiteit, en met name het hoge niveau van genomische redundantie die simpele genetica in hogere planten. De nieuwe modelorganisme Ostreococcus tauri de kleinste vrijlevende eukaryote tot dusver bekend, en heeft een sterk verminderde genoomgrootte en cellulaire complexiteit 1,2, blijkt uit de aanwezigheid van slechts een van de organellen (mitochondrion, chloroplast, Golgi stack) per cel en een genoom dat alleen ~ 8000 genen. Bovendien is de combinatie van unicellularity gemakkelijk cultuur een platform vatbaar chemische biologie benaderingen. Onlangs heeft Ostreococcus met succes gebruikt om fundamentele mechanismen ten grondslag liggen aan circadiane tijdwaarneming 3-6 te bestuderen. De resultaten van dit model organisme zijn niet alleen gevolgen voor planten wetenschap, maar ook zoogdieren biologie 7. Dit voorbeeld maakt hoe snel experimenten in eeneenvoudige eukaryoot van de groene lijn kan versnellen onderzoek in meer complexe organismen door het genereren van toetsbare hypothesen met behulp van methoden technisch mogelijk alleen in de achtergrond van de verminderde complexiteit. Kennis van een genoom en de mogelijkheid om genen te passen essentiële elementen zijn in een model soort. Genomic 1, transcriptoom 8 en 9 Proteoom informatie voor deze soort is vrij beschikbaar, terwijl de eerder gemelde 6,10 methoden om genetisch te transformeren Ostreococcus is bekend dat ze enkele laboratoria overal ter wereld.
In dit artikel, de proefmethoden genetisch transformeren deze nieuwe modelorganisme overexpressie construeren door middel van elektroporatie worden beschreven in detail, alsmede de wijze van toevoeging van getransformeerde cellen bij lage percentage agarose om selectie van getransformeerde lijnen afkomstig van een een getransformeerde cel. Na de succesvolle toepassing van Ostreococcus naar circadiane onderzoek kan groeiende belangstelling voor Ostreococcus worden verwacht van diverse onderzoeksgebieden binnen en buiten Plant Sciences, met inbegrip van biotechnologische gebieden. Onderzoekers van een breed scala aan biologische en medische wetenschappen die werken aan geconserveerde biochemische pathways kunnen overwegen bezighouden met onderzoek in Ostreococcus, vrij van de genomische en organismaal de complexiteit van groter model soorten.
Cellulaire staat en cultuur axeny is van cruciaal belang voor de transformatie procedure. Hoewel cellen worden meestal onderhouden in cycli van 12 uur licht en werden 12 uur donker, efficiëntie van de omzetting in cellen gekweekt onder deze omstandigheden onvoldoende blijken te zijn. Tijdens de herhaalde pellets / resuspensie stappen moeten cellen altijd gemakkelijk mengen. Als cellen aggregaat, of een slijm-achtige substantie aanwezig is, is het beter om de procedure opnieuw te beginnen vanaf het begin. Meestal kan ~ 50 kolonies worden verwacht op elke transformatie plaat, ten opzichte van niets op de negatieve controle plaat. Bij lage efficiëntie van de omzetting dient teeltomstandigheden worden gevarieerd om cellen in de optimale stand. Variabelen die transformatie efficiëntie beïnvloeden, zijn onder de omgevingstemperatuur in het laboratorium (moet in de buurt van 20 ° C zijn) en de behandeling snelheid (Procedure van pelleteren cellen [2,3] naar herstel [2,7] moet ~ 1 uur duren). Het is ook belangrijk dat oplossingen eenre gemaakt vers voor elke transformatie. Voor opname in platen, de concentratie van LMP agarose essentieel. Ostreococcus cellen groeien niet in hoge concentraties agarose, en diffunderen in lage concentraties.
Drie transformatievectoren voor Ostreococcus zijn eerder gepubliceerd 6, en nog veel meer vectoren zullen naar verwachting worden gegenereerd en binnenkort gepubliceerd. De bestaande vector Pot-Luc 6 maakt het gebruik van een promotor naar keuze in combinatie met een C-terminale vuurvlieg luciferase-tag waardoor een snellere transgene lijn selectie plus handelbaar expressie patronen, terwijl de Potox vector 6 draagt de sterke induceerbare 13 promotor uit de Ostreococcus hoge affiniteit fosfaat Transporteur (HAPT) gen voor overexpressie van het gen van belang. De Potox-Luc vector afgeleid van Potox, die een extra luciferase marker kan worden gebruikt voor indirecte selectie van lijnen overexpressie <sup> 14. Succesvolle selectie markers op deze vectoren zijn Nourseothricin en G148. Echter Ostreococcus cellen zeer goed bestand tegen verschillende antibiotica en de concentraties van verbindingen die nodig zijn voor selectie van transgene Ostreococcus cellen hoger dan bij conventionele modelsysteem (2 mg / ml).
Hoewel de werkwijze weergegeven inefficiënt het grote aantal cellen en plasmide DNA nodig voor deze werkwijze vormt geen significante hindernis. Een grotere beperking is dat elke opgewekte lijn die bestand is tegen de selecteerbare marker dient te worden geanalyseerd om te controleren of de gehele constructie is geïntegreerd in de DNA. Wij hebben opgemerkt voorbeelden waarin succesvolle expressie van de selecteerbare marker niet overeen met het inbrengen van het genproduct van interesse, dat wil zeggen gedeeltelijke integratie optreden. Blijkbaar willekeurige integratie in het genoom betekent ook dat er geen beperking van de insteekopening deze methode en methoden bebaseerd op homologe recombinatie worden momenteel ontwikkeld. Echter, de hier beschreven methode is, naar ons beste weten, momenteel de enige gekenmerkt methode om genetisch gemodificeerde Ostreococcus cellen te genereren.
Als Ostreococcus Tauri is pas sinds kort gebruikt als experimenteel model organisme, de meeste methoden het werken met deze cellen voor verandering vatbaar is en verfijnd worden door de groeiende betrokken onderzoeksgemeenschap. Dit protocol is bedoeld om mensen te helpen werk te starten met Ostreococcus, maar op geen enkele wijze beweert te beschrijven alles wat er te weten valt over genomische transformatie van deze microalga. De auteurs vertrouwen dat lezers in staat zijn om dit protocol aan te passen aan hun eigen behoeften als kleine verschillen in de incubators (licht of kwaliteit) en andere parameters zal bestaan en waarschijnlijk geoptimaliseerd moeten worden in ieder afzonderlijk laboratorium naar de gezonde culturen die nodig zijn voor deze te verkrijgen protocol. Na het beheersen van de technieken die hier beschreven,vectoren kunnen worden geconstrueerd luminescerende, fluorescent of andere gelabeld fusie lijnen onder besturing van een aantal promotoren genereren. Deze spannende roman experimenteel platform zal nuttig zijn om te onderzoeken hoe ingewikkelde biochemische problemen worden opgelost in een eukaryoot van verminderde complexiteit, waarbij farmacologische benaderingen zeer vergemakkelijkt worden 3.
The authors have nothing to disclose.
SynthSys een Centre for Integrative Systems Biology gefinancierd door BBSRC en EPSRC award D019621. EU FP6 Network of Excellence 'Marine Genomics "subsidie aan Fyb heeft gefinancierd ontwikkeling van genetische transformatie methoden.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |