이 문서는 단세포 해양 alga의 유전자 변형을 설명합니다<em> Ostreococcus 타우 리</em> electroporation에 의해. 이것은 진핵 생물은 크게 감소 게놈 및 세포 복잡 possesing과 세포 배양 및 화학 생물학 모두에게 쉽게받을 수있는 권력으로 높은 식물을위한 효과적인 모델의 플랫폼입니다.
식물 과학의 급속한 발전을 방해 일반적인 문제는 세포, 조직과 전체 유기체의 복잡하고 높은 식물의 간단한 유전자에 영향을 미치는 게놈 중복 특히 높은 수준을 포함합니다. 소설 모델 유기체 Ostreococcus 타우 리가 날짜로 알려진 작은 자유 생활 진핵세포 생물이며, 당 가장 organelles 중 하나 (mitochondrion, 엽록체, 잠돌군 Zz 스택)의 존재에 의해 나타냄 크게 감소 게놈의 크기와 셀룰러 복잡성 1,2를 가지고 셀, 오로지 ~ 8000 유전자를 포함하는 게놈. 또한, unicellularity 쉽게 문화의 결합 화학 생물 접근 의무가 플랫폼을 제공합니다. 최근 Ostreococcus이 성공적으로 circadian 측정 3-6 근본 기본적인 메커니즘을 연구하기 위해 고용되었다. 이 모델 생물의 결과는 또한 포유류의 생물학 7 식물 과학뿐만 아니라 영향을했지만. 이 예제에서 얼마나 빠른 실험을 강조녹색 혈통에서 간단한 진핵세포 생물은 낮은 복잡도의 배경으로 기술적으로 실현 가능한 방법을 사용 testable 가설을 생성하여보다 복잡한 유기체의 연구를 가속화할 수 있습니다. 게놈과 유전자를 수정하기위한 가능성에 대한 지식은 어떤 모형 수종에 필수적인 도구입니다. 유전자 Ostreococcus를 변환하기 이전에 보고된 방법 6,10가 전세계적으로 몇 가지 실험실로 알려진 반면 게놈 1, Transcriptomic 8이 종족에 대한 Proteomic 아홉 정보는 자유롭게 사용할 수 있습니다.
이 문서에서는 실험 방법은 유전자 electroporation에 의해 구조가 자세히 설명뿐만 아니라 변형 라인의 선택에서 발생하는 허용하는 낮은 비율 아가로 오스의 변형 세포를 포함하는 방법있다 overexpression로이 소설을 모델 유기체를 변환하는 방법 하나는 휴대폰을 바꾸었다. Ostreoco의 성공적인 응용 프로그램에 따라circadian 연구 ccus, Ostreococcus에 관심이 점점이 biotechnological 분야를 포함하여 식물의 과학, 내 및 외부의 다양한 연구 분야에서 기대할 수 있습니다. 보존 생화 학적 경로에서 작동 생물 학적 및 의료 과학의 광범위한 범위에서 연구가 더 큰 모델 종의 게놈과 organismal 복잡도에서 해방 Ostreococcus에서 추구하는 연구를하는 것이 좋습니다.
세포 주 및 문화 axeny은 변환 과정에 중요한 중요하다. 세포는 일반적으로 빛의 12 시간주기에서 유지되고 있지만, 12 시간 어둡고, 이러한 조건 하에서 성장 세포의 변환 효율이 부족한 것으로 밝혀졌다. 반복 pelleting / resuspension 단계 동안, 세포는 항상 쉽게 resuspend한다. 세포의 집계, 또는 가래 같은 물질이 존재할 경우, 다시 처음부터 절차를 시작하는 것이 좋습니다. 일반적으로 ~ 50 콜로니는 부정적인 컨트롤 접시 없음 비해, 각 변환 접시에 기대할 수 있습니다. 낮은 변환 효율 경우에는 culturing 조건은 세포가 최적의 상태에 있도록 다양한되어야합니다. 변환 효율에 영향을 미치는 변수는 주위 실험실에서 온도 (주변 20 ° C로 함) 및 처리 속도를 (세포에게 [2.3] 회복에 대한 [2.7]을 pelleting의 절차 ~ 1 시간 정도 소요됩니다)가 있습니다. 그것은 또한 중요하다 모든 솔루션다시 각각의 변형 전에 신선했다. 접시에 포함시킬 경우, LMP 아가로 오스의 농도는 Ostreococcus 전지는 높은 아가로 오스의 농도에서 성장하지 않습니다. 중요하고, 낮은 농도로 확산됩니다.
Ostreococcus 위해 만세 변환 벡터는 이전에 다음 여섯 출판되었으며, 더 많은 벡터가 생성하고 곧 출판할 예정이다. Potox 벡터 6 Ostreococcus에서 촬영한 강력한 inducible 13 promotor를 전해준 반면 기존의 벡터 주전자 룩 6, 빠른 유전자 변형 라인 선택 플러스 다루기 쉬운 표현 패턴을 허용 C-단자 반딧불 루시페라제 태그와 함께 선택의 promotor의 사용을 허용 관심있는 유전자의 overexpression에 대한 고친 화성 인산 수송 (HAPT) 유전자. Potox 룩 벡터는 overexpression 라인 간접 선택에 사용할 수있는 추가 루시페라제 마커를 들고, Potox에서 유래 <s14>까지. 이러한 벡터에 대한 성공적인 선택 마커 Nourseothricin와 G148입니다. 그러나 Ostreococcus 세포는 여러 항생제에 높은 내성이며, 유전자 변형 Ostreococcus 전지의 선정에 필요한 화합물의 농도는 기존 모델 시스템 (2 밀리그램 / ML)에 비해 높다.
프로세스가 비효율적 보이지만 세포이 절차에 필요한 플라스미드 DNA의 다수는 더 큰 장애물을 포즈 없습니다. 큰 제한은 선택 마커에 강한있는 모든 생성된 라인 전체 구조는 DNA에 통합되어 있는지 확인하기 위해 개별적으로 분석해야한다는 것입니다. 우리는 선택할 수있는 마커를 성공적으로 표현 관심의 실제 유전자의 삽입에 해당하지 않은 것들에 예제를 감찰하러 온 적도, 즉 부분적인 통합이 발생할 수 있습니다. 결국, 게놈에 무작위로 삽입도이 방법을 사용하여 삽입 사이트에 대한 통제가 없다는 것을 의미하고, 방법 B동종 재조합에 ased 현재 개발되고있다. 그러나, 방법은, 우리의 가장 중요한 지식까지, 여기 유전자 변형 Ostreococcus 세포를 생성하는 현재 유일한 특성화 방법을 설명했다.
Ostreococcus 타우 리가 최근에 실험적인 모델 생물로 사용되고 마찬가지로,이 전지 작업에 대부분의 방법은 진화와 관련된 성장 연구 커뮤니티에 의해 세련되지 가능성이 높습니다. 이 프로토콜은 사람들이 Ostreococcus 함께 작업을 시작할 수 있도록하기위한, 그런데 방법으로이 microalga의 게놈 변이에 대해 알고있다 모두를 설명하는 데 있다고 주장한다. 독자가 작은 incubators의 차이 (조명 수준이나 품질) 및 기타 매개 변수가 존재합니다로서 자신의 요구에이 프로토콜을 적응하고 가능성이 필요한 건강한 문화를 얻기 위해 모든 개별 연구실에 최적화해야 할 수있을 것이라고 저자 신뢰 프로토콜. 습득 후 기술, 여기에 설명된벡터는 promotors의 범위의 통제하에 발광, 형광 또는 기타 태그가 퓨전 라인을 생성하는 건설 수 있습니다. 이 흥미 진진한 소설의 실험 플랫폼은 복잡한 생화 학적 문제 pharmacological 접근은 고도 3 촉진되는 감소 복잡도의 진핵세포 생물에서 해결하는 방법을 공부하는 것이 유용할 것이다.
The authors have nothing to disclose.
BBSRC과 EPSRC 수상 D019621에 의해 자금 지원 통합 시스템 생물학을위한 센터 SynthSys. FYB에 우수 '마린 지노 믹스 "보조금의 유럽 연합 (EU) FP6 네트워크는 유전자 변형 방법의 개발 자금을하고있다.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |