En este artículo se describe la transformación genética del alga marina unicelular<em> Ostreococcus tauri</em> Por electroporación. Este organismo eucariota es una plataforma modelo eficaz para las plantas superiores, que parecen haber reducido en gran medida la complejidad genómica y celular y ser fácilmente susceptibles de cultivo celular y biología química.
Los problemas más comunes que impiden un rápido progreso en Ciencias de la planta incluyen tejido celular y la complejidad del organismo, y en particular el alto nivel de redundancia genómica que afecta a la genética simples en las plantas superiores. La novela de organismo modelo Ostreococcus Tauri es la más pequeña de vida libre eucariota conocido hasta la fecha, y posee un tamaño de genoma reducido en gran medida la complejidad celular y 1,2, que se manifiesta por la presencia de sólo uno de la mayoría de los orgánulos (mitocondrias, los cloroplastos, pila de Golgi) por celda, y un genoma que contiene sólo ~ 8000 genes. Además, la combinación de unicellularity y fácil cultivo proporciona una plataforma susceptible de enfoques de biología químicos. Recientemente, Ostreococcus ha sido empleado con éxito para estudiar los mecanismos básicos que subyacen a la hora normal circadiano 3-6. Los resultados de este organismo modelo han tenido un impacto no sólo ciencia de las plantas, sino también la biología de los mamíferos 7. Este ejemplo pone de relieve cómo la experimentación rápida en uneucariota sencillo del linaje verde puede acelerar la investigación en organismos más complejos mediante la generación de hipótesis comprobables mediante métodos técnicamente viables sólo en este contexto de menor complejidad. El conocimiento del genoma y la posibilidad de modificar los genes son herramientas esenciales en cualquier especie de modelo. 1 Genómica, transcriptómica 8, 9 y Proteómica información para esta especie está disponible gratuitamente, mientras que los métodos reportados previamente 6,10 para transformar genéticamente Ostreococcus se sabe que pocos laboratorios en el mundo.
En este artículo, los métodos experimentales para transformar genéticamente este organismo modelo nuevo con una sobreexpresión construir mediante electroporación se describen en detalle, así como el método de inclusión de las células transformadas en porcentaje de agarosa de bajo para permitir la selección de líneas transformadas procedentes de una sola transformada celular. A raíz de la aplicación exitosa de OstreocoCCU a la investigación circadiano, el interés creciente en Ostreococcus se puede esperar de diversas áreas de investigación dentro y fuera de las ciencias de las plantas, incluidas las áreas biotecnológicas. Los investigadores de una amplia gama de ciencias biológicas y médicas que trabajan en conservadas vías bioquímicas puede considerar la investigación buscando en Ostreococcus, libre de la complejidad genómica y organismal de las especies modelo más grande.
Axeny Celular Estado y la cultura es de vital importancia para el procedimiento de transformación. Aunque las células se mantienen normalmente en ciclos de 12 horas de luz, 12 horas oscuro, la eficiencia de transformación en las células cultivadas bajo estas condiciones se encontraron a ser insuficiente. Durante los repetidos granulación / resuspensión pasos, las células deben siempre resuspender fácilmente. Si el agregado células, o de una sustancia con apariencia de moco está presente, es mejor iniciar el procedimiento desde el principio otra vez. Típicamente, ~ 50 colonias se puede esperar en cada placa de transformación, frente a ninguno en la placa de control negativo. En el caso de la eficiencia de transformación bajo, condiciones de cultivo deben ser variados para asegurar las células están en el estado óptimo. Variables que afectan la eficiencia de transformación se encuentran la temperatura ambiente en el laboratorio (en caso de estar cerca de 20 ° C) y velocidad de manipulación (Procedimiento de la sedimentación de células [2,3] para la recuperación [2,7] se deberían tener aproximadamente 1 hora). También es importante que todas las soluciones aRe frescas antes de cada transformación. Para su inclusión en las placas, la concentración de agarosa LMP es crucial. Células Ostreococcus no crecerá en altas concentraciones de agarosa, y se difundirá en bajas concentraciones.
Tres vectores de transformación para Ostreococcus han sido publicados anteriormente 6, y más vectores se espera que se genera y se publicará en breve. El vector existente Pot-Luc 6 permite el uso de un promotor de elección en combinación con una etiqueta C-terminal de la luciferasa de luciérnaga permitiendo la selección de línea más rápida transgénico más manejables patrones de expresión, mientras que el vector Potox 6 lleva el promotor inducible fuerte 13 tomada desde el Ostreococcus Fosfato de alta afinidad Transportador (HAPT) de genes para la sobreexpresión del gen de interés. El vector Potox-Luc deriva de Potox, llevando un marcador luciferasa adicional que puede ser utilizado para la selección indirecta de las líneas de sobreexpresión <sa> 14. El éxito de los marcadores de selección en estos vectores son nourseothricin y G148. Sin embargo, las células Ostreococcus son altamente resistentes a muchos antibióticos, y las concentraciones de los compuestos necesarios para la selección de las células transgénicas Ostreococcus es mayor que para los sistemas de modelo convencional (2 mg / ml).
Aunque el proceso parece ineficiente, el gran número de células y el ADN plásmido necesaria para este procedimiento no plantea ningún obstáculo significativo. Una limitación más importante es que cada línea generada que es resistente al marcador seleccionable necesita ser analizada individualmente para comprobar que toda la estructura se integra en el ADN. Hemos observado ejemplos en los que la expresión con éxito de la marcador seleccionable no corresponden a la inserción del gen de interés real; integraciones parciales, es decir puede ocurrir. Evidentemente, la inserción aleatoria en el genoma también significa que no hay control de la zona de inserción utilizando este método, y b métodoson base en la recombinación homóloga se están desarrollando actualmente. Sin embargo, el método descrito aquí es, a nuestro leal saber y entender, actualmente el único método caracterizado para generar células modificadas genéticamente Ostreococcus.
Como Ostreococcus tauri sólo recientemente ha sido utilizado como un organismo modelo experimental, la mayoría de los métodos de trabajo con estas células es probable que evolucionar y ser refinado por la comunidad científica cada vez más involucrados. Este protocolo está pensado para ayudar a la gente a iniciar el trabajo con Ostreococcus, pero de ninguna manera pretende describir todo lo que hay que saber acerca de la transformación genómica de esta microalga. Los autores la confianza que los lectores serán capaces de adaptar este protocolo a sus propias necesidades como las pequeñas diferencias en las incubadoras (los niveles de luz o de calidad) y otros parámetros que existen y que probablemente tienen que ser optimizadas en cada laboratorio en particular para obtener las culturas saludables necesarios para este protocolo. Después de dominar las técnicas descritas aquí,vectores pueden ser construidos para generar fluorescente luminiscente, u otros etiquetados líneas de fusión bajo el control de una amplia gama de promotores. Esta plataforma apasionante novela experimental será útil para estudiar cómo complicados problemas bioquímicos se resuelven en un eucariota de la reducción de la complejidad, en que los enfoques farmacológicos son muy facilitada 3.
The authors have nothing to disclose.
SynthSys un Centro para la Biología de Sistemas Integral financiado por el BBSRC y adjudicación EPSRC D019621. 6 º PM de la UE Red de Excelencia "Genómica Marina" subvención a FYB ha financiado el desarrollo de métodos de transformación genética.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |