توضح هذه المقالة التحول الجيني للطحلب البحرية وحيدة الخلية<em> Ostreococcus tauri</em> من جانب electroporation. هذا الكائن هو منصة حقيقية النواة نموذج فعال لارتفاع النباتات، وتقلص إلى حد كبير possesing تعقيد الجينومية والخلوية وكونها قابلة بسهولة للثقافة الخلية والبيولوجيا الكيميائية على حد سواء.
المشاكل المشتركة التي تعوق التقدم السريع في علوم النبات وتشمل الخلوية والأنسجة وتعقيد الكائن الحي كله، وخصوصا على مستوى عال من التكرار الجيني التي تؤثر على الوراثة بسيط في النباتات العليا. الكائن الحي نموذج رواية Ostreococcus tauri هو أصغر حرة المعيشة حقيقي النواة معروف حتى الآن، وتمتلك حجم الجينوم تقلص إلى حد كبير والخلوية 1،2 التعقيد، والذي تجلى من خلال وجود واحد فقط من معظم العضيات (الحبيبات الخيطية، بلاستيدات الخضراء، جولجي كومة) في الخلية، والتي تحتوي على الجينوم فقط ~ 8000 الجينات. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين unicellularity والثقافة سهل توفر منصة قابلة للنهج البيولوجيا الكيميائية. مؤخرا، تم Ostreococcus استخدامها بنجاح لدراسة الآليات الأساسية الكامنة وراء ضبط الوقت الإيقاعية 3-6. وقد أثرت نتائج من هذا الكائن الحي نموذج ليس فقط علوم النبات، ولكن أيضا بيولوجيا الثدييات 7. ويوضح هذا المثال كيف التجريب السريع فييمكن حقيقي النواة بسيط من سلالته الخضراء تسريع البحوث في كائنات حية أكثر تعقيدا عن طريق توليد الفرضيات القابلة للقياس باستخدام وسائل ممكنة من الناحية التقنية فقط في هذه الخلفية من تعقيد مخفضة. علم الجينوم وإمكانية لتعديل الجينات هي أدوات لا غنى عنها في أي نوع نموذجي. الجينومية 1، Transcriptomic 8، والبروتين 9 معلومات عن هذه الأنواع هي متاحة بحرية، في حين من المعروف أن الأساليب وذكرت سابقا 6،10 لتحويل وراثيا Ostreococcus إلى المختبرات القليلة على مستوى العالم.
في هذه المقالة، والطرق التجريبية وراثيا لتحويل هذا الحي نموذج الرواية مع overexpression ترد عن طريق بناء electroporation بالتفصيل، فضلا عن طريقة إدراج الخلايا تحولت في الاغاروز انخفاض النسبة المئوية للسماح للاختيار من خطوط تحويل منشؤها من واحد تحول الخلية. بعد التطبيق الناجح للOstreococcus للبحوث الإيقاعية، يمكن توقع تزايد الاهتمام في Ostreococcus من المجالات البحثية المختلفة داخل وخارج علوم النبات، بما في ذلك مجالات التكنولوجيا الحيوية. يمكن للباحثين من طائفة واسعة من العلوم البيولوجية والطبية التي تعمل على المسارات البيوكيميائية حفظها النظر في البحوث السعي في Ostreococcus، وخالية من التعقيد الجيني والعضوي من نوع أكبر نموذج.
الخلوية الدولة وثقافة axeny له أهمية حاسمة بالنسبة لإجراء تحول. على الرغم من أن يتم الاحتفاظ عادة الخلايا في دورات من 12 ساعة ضوء ذلك، تم العثور على 12 ساعة مظلمة، وكفاءة في تحويل خلايا نمت في ظل هذه الظروف غير كافية. خلال الخطوات التكوير / إعادة تعليق المتكررة، يجب أن الخلايا resuspend دائما بسهولة. إذا خلايا الكلية، أو على مادة تشبه المخاط موجودا، فمن الأفضل لبدء هذا الإجراء من البداية مرة أخرى. عادة، يمكن توقع ~ 50 المستعمرات في كل لوحة تحول، مقابل لا شيء على لوحة تحكم سلبي. في حالة انخفاض كفاءة التحويل، ينبغي أن تختلف ظروف زراعة لضمان الخلايا هي في حالة مثلى. المتغيرات التي تؤثر على كفاءة تحويل وتشمل درجة الحرارة المحيطة في المختبر (يجب أن تكون قريبة من 20 درجة مئوية)، وسرعة التعامل مع (إجراء من التكوير خلايا [2.3] لاسترداد [2،7] ينبغي أن تأخذ ~ 1 ساعة). من المهم أيضا أن كل الحلول 1جعل إعادة الطازجة قبل كل تحول. لإدراجها في لوحات، وتركيز الاغاروز LMP أمر بالغ الأهمية. الخلايا Ostreococcus لن تنمو في تركيزات عالية الاغاروز، وسيتم نشرها في التركيزات المنخفضة.
وقد تم نشر ثلاث ناقلات تحول لOstreococcus سابقا 6، ويتوقع المزيد من ناقلات إلى أن ولدت، ونشرت في وقت قريب. الموجه الحالية وعاء لوك 6 يسمح استعمال promotor من خيار في تركيبة مع علامة اليراع C-محطة luciferase المراسل السماح أسرع المعدلة وراثيا اختيار خط زائد أنماط التعبير لين العريكة، في حين أن ناقلات Potox 6 يحمل قوي محرض 13 promotor مأخوذة من Ostreococcus ارتفاع الناقل الفوسفات الانجذاب (اللمس) جين overexpression من هذا الجين من الفائدة. الموجه Potox لوك مستمد من Potox، يحمل علامة luciferase المراسل الإضافية التي يمكن استخدامها لاختيار غير المباشرة للخطوط overexpression <sحتى 14>. علامات اختيار ناجح على هذه النواقل هي Nourseothricin و G148. ومع ذلك، الخلايا Ostreococcus هي مقاومة عالية للكثير من المضادات الحيوية، وتركيزات المركبات الضرورية لتحديد الخلايا المعدلة وراثيا Ostreococcus أعلى من النموذج التقليدي للنظم (2 ملغ / مل).
على الرغم من أن عملية يبدو غير فعال، وعدد كبير من الخلايا والحمض النووي البلازميد اللازمة لهذا الإجراء لا يشكل عقبة كبيرة. وأكبر القيد هو أن كل خط المولدة التي هي مقاومة للعلامة اختيار يحتاج إلى تحليل فردي للتأكد من أن يتم دمج كامل التركيبة في الحمض النووي. وقد لاحظنا في الأمثلة التي التعبير الناجح لعلامة اختيار لم تكن مناسبة للادراج في الجينات الفعلية في المصالح؛ التكاملات أي جزئية يمكن أن يحدث. من الواضح، الإدراج عشوائية في جينوم يعني أيضا أنه ليست هناك سيطرة من موقع الإدراج باستخدام هذا الأسلوب، وأساليب بويجري حاليا ased على إعادة التركيب مماثل يجري وضعها. ومع ذلك، وصفت طريقة هنا هو، لمعرفة أفضل لنا، في الوقت الراهن أسلوب يتميز فقط على توليد خلايا Ostreococcus المعدلة وراثيا.
كما تم مؤخرا فقط Ostreococcus tauri تستخدم كائن النموذج التجريبي، ومعظم أساليب العمل مع هذه الخلايا من المحتمل أن تتطور ويتم تكريره من قبل الأوساط البحثية المتنامية المعنية. ويهدف هذا البروتوكول لمساعدة الناس على الشروع في العمل مع Ostreococcus، ولكن بأي حال من الأحوال يدعي لوصف كل ما يمكن معرفته عن التحول الجيني لهذا microalga. على ثقة من الكتاب أن القراء سوف تكون قادرة على التكيف مع هذا البروتوكول لاحتياجاتها الخاصة والفروق الصغيرة في الحاضنات (مستويات الضوء أو النوعية) وغيرها من المعالم وجود وسوف يكون من المحتمل أن يكون الأمثل في كل مختبر الفردية للحصول على الثقافات الصحية اللازمة لهذا بروتوكول. بعد اتقان التقنيات وصفت هنا،ويمكن بناء ناقلات لتوليد الانارة، فلوري، أو غيرها من خطوط الانصهار الموسومة تحت سيطرة مجموعة من الدعاة. وهذه التجارب رواية مثيرة منصة مفيدة لدراسة كيفية حل مشاكل معقدة البيوكيميائية في خفض حقيقي النواة من التعقيد، والتي هي سهلت للغاية نهج الدوائية 3.
The authors have nothing to disclose.
SynthSys مركز بيولوجيا الأنظمة التكاملية تموله BBSRC وجائزة EPSRC D019621. وقد مول الاتحاد الأوروبي FP6 شبكة التميز منحة "الجينوم البحرية" لFYB تطوير أساليب التحول الجيني.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |