本文介绍了单细胞海藻的遗传转化<em> Ostreococcus金牛</em>电。这是真核有机体的有效模式,为高等植物平台,possesing基因和细胞的复杂性大大降低,并随时服从细胞培养和化学生物学。
阻碍植物科学的快速进步的共同问题,包括细胞,组织和整个生物体的复杂性,尤其是高层次的基因冗余影响在高等植物中的简单的遗传学研究。新模型的有机体Ostreococcus金牛是迄今已知最小的自由生活真核生物,拥有大大降低的基因组大小和细胞复杂1,2,表现的只是其中的大多数细胞器(线粒体,叶绿体,高尔基栈)每存在细胞,只有约8000个基因的基因组。此外,结合unicellularity和易于文化提供了一个平台,适合化学生物学方法。最近,Ostreococcus已成功地采用了以研究昼夜报时3-6的基本机制。从这个模型有机体的结果,这不仅影响植物科学,但也哺乳动物生物学7。这个例子强调如何在一个快速实验从简单的真核生物的绿色系可以加速在更复杂的生物体产生可验证的假设使用技术上是可行的,只有在这个背景降低复杂性的方法研究。在任何模式物种基因组和基因修改的可能性的知识是必不可少的工具。转录基因组1,8,9蛋白质组学这一物种的信息是免费提供的,而以前报道的方法6,10到基因改造Ostreococcus的被称为世界各地的一些实验室。
在这篇文章中,实验方法,以基因改造与过度新型模式生物电建设中概述的细节,以及列入在低百分比琼脂糖转化细胞的方法,允许选择转换线从原产单细胞。继成功Ostreoco应用日益增长的兴趣在Ostreococcus昼夜研究ccus到,可以预计从不同的研究领域内,外植物科学,包括生物技术领域。研究人员从一个保守的生化途径的生物学和医学科学的范围广泛,可考虑追求在Ostreococcus的研究,从更大的模式物种的基因组和生物体的复杂性。
细胞状态和文化axeny是至关重要的转型过程中。虽然细胞通常保持在12小时光照周期,12小时黑暗,被发现在这些条件下生长的细胞转化效率不足。在重复制粒/再悬浮步骤,细胞总是容易悬浮。如果细胞聚集,或粘液样物质存在,它是更好的再次从头开始的过程。通常情况下,50殖民地,可以预计在每个转换板,与阴性对照板没有。转化效率低的情况下,应改变培养条件,以确保细胞在最佳状态。影响转化效率的变量,包括在实验室的环境温度(应该接近到20°C)和处理速度(制粒细胞[2.3]恢复[2.7]程序应采取〜1小时)。同样重要的是,所有的解决方案重新取得了新的前每个转换。列入对于板块中,低熔点琼脂糖的浓度是至关重要的。Ostreococcus细胞不会生长在高琼脂糖浓度,并会在低浓度扩散。
三个转化载体Ostreococcus已发表 过6,预计将产生更多的载体,短期内公布。现有的矢量吕克6罐允许结合的启动子的选择与使用的C-末端的萤火虫荧光素酶标记允许更快的转基因株系的选择加听话的表达模式,而进行的Potox载体6强诱导13启动子从的Ostreococcus采取高亲和磷转运(HAPT)感兴趣的基因表达的基因。 Potox吕克载体派生从Potox,携带一个额外的过度线的间接选择可以使用的荧光素酶标记<s高达> 14。这些载体成功的选择标记Nourseothricin的的和G148。然而,Ostreococcus细胞对多种抗生素耐药,并选择转基因Ostreococcus细胞所必需的化合物的浓度高于传统模型系统(2毫克/毫升)。
虽然过程中出现的效率低下,在此过程所需的细胞和质粒DNA的大量不构成重大障碍。每产生抗性选择标记的线,是需要单独进行分析检查,整个结构的DNA相结合,是一个较大的限制。我们观察到的例子,在选择标记的成功表达不符合利益的实际基因插入;即部分的集成可以发生。由此可见,随机插入到基因组也意味着,有没有使用此方法插入网站的控制,方法B同源重组的层次正在开发。然而,该方法这里描述的是,我们所知,目前只有特点的方法来产生转基因Ostreococcus细胞。
正如金牛Ostreococcus最近才被作为实验模式生物,大多数这些细胞的方法很可能被越来越多的研究涉及社会发展和细化。该协议旨在帮助人发起与Ostreococcus工作,但绝不声称来形容,有了解这微藻基因改造。作者的信任,读者将这个协议能够适应自己的需求小的差异,在孵化器(光水平或质量)和其他参数会存在,并有可能在每一个人的实验室进行了优化,获得此需要的健康文化协议。这里描述后掌握的技术,可以构造向量产生发光,荧光或其他标记的融合线,在控制的范围助剂。这个令人振奋的新的实验平台,将是有益的探讨如何降低复杂性,在药理方法非常方便3真核生物解决复杂的生化问题。
The authors have nothing to disclose.
SynthSys 1由BBSRC和EPSRC的奖D019621资助结合系统生物学中心。欧盟FP6的卓越“海洋生物功能基因”的拨款,以FYB网络已资助的遗传转化方法的发展。
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |