Dieser Artikel beschreibt die genetische Transformation der einzelligen Alge<em> Ostreococcus tauri</em> Durch Elektroporation. Diese eukaryotischen Organismus ist ein gutes Modell-Plattform für höhere Pflanzen, possesing stark reduziert genomischen und zellulären Komplexität und wobei sich gut für die sowohl Zellkultur und Biochemie.
Häufige Probleme behindert schnelle Fortschritte in Plant Sciences zählen Zell-, Gewebe und ganzen Organismus Komplexität und vor allem das hohe Niveau der genomischen Redundanz beeinflussen einfache Genetik in höheren Pflanzen. Das erfindungsgemäße Modellorganismus Ostreococcus tauri ist die kleinste frei lebenden eukaryotischen bisher bekannten und besitzt einen stark reduzierten Genomgröße und zelluläre Komplexität 1,2, durch die Anwesenheit von nur einer der Organellen (Mitochondrien, Chloroplasten, Golgi) pro manifestiert Zelle, und ein Genom, das nur ~ 8000 Gene. Weiterhin stellt die Kombination von unicellularity und einfache Kultur eine Plattform zugänglich chemische Ansätze. Vor kurzem hat Ostreococcus erfolgreich eingesetzt, um grundlegende Mechanismen der zirkadianen Zeitmessung 3-6 studieren. Die Ergebnisse dieser Modell-Organismus haben nicht nur Plant Science beeinflusst, sondern auch Säugetierbiologie 7. Dieses Beispiel macht deutlich, wie schnell ein Experimentieren ineinfache Eukaryoten aus der grünen Linie kann die Forschung in komplexeren Organismen beschleunigen durch die Erzeugung überprüfbare Hypothesen mit Methoden technisch möglich nur in diesem Zusammenhang von geringerer Komplexität. Wissen eines Genoms und die Möglichkeit, Gene zu verändern sind unverzichtbare Werkzeuge in jedem Modell Arten. Genomic 1, Transkriptom 8, 9 und Proteom-Daten für diese Spezies ist frei verfügbar, während die zuvor berichteten Methoden zu 6,10 genetisch verändern Ostreococcus zu wenige Labors weltweit bekannt sind.
In diesem Artikel, um die experimentellen Verfahren, genetisch transformierbar diese neuartigen Modell Organismus mit einer Überexpression Konstrukt mittels Elektroporation werden im Detail beschrieben, sowie das Verfahren der Aufnahme von transformierten Zellen in geringen Prozentsatz Agarose die Selektion transformierter Linien von einem bestimmten einzigen transformierten Zelle. Nach der erfolgreichen Anwendung der OstreocoCCUs zu circadianen Forschung, kann wachsendes Interesse an Ostreococcus aus verschiedenen Forschungsbereichen innerhalb und außerhalb der Botanik einschließlich biotechnologischen Bereichen zu erwarten. Forscher aus einem breiten Spektrum von biologischen und medizinischen Wissenschaften, die auf biochemischen Wege konservierte arbeiten kann prüfen, forscht in Ostreococcus, frei von genomischer und organismischen Komplexität des größeren Modells Arten.
Cellular Staat und Kultur axeny ist von entscheidender Bedeutung für die Transformation Prozedur. Obwohl die Zellen üblicherweise in Zyklen von 12 Stunden Licht gehalten werden, wurden 12 Stunden Dunkelheit, Transformationseffizienz in Zellen unter diesen Bedingungen angebaut wird unzureichend zu sein. Während der wiederholten Pelletierung / Resuspension Schritte sollten die Zellen immer leicht zu resuspendieren. Wenn Zellen aggregieren, oder ein Schleim-ähnliche Substanz vorhanden ist, ist es besser, das Verfahren wieder von vorne beginnen. In der Regel können ~ 50 Kolonien auf jeder Platte Transformation gerechnet werden, im Vergleich zu keiner auf der Negativ-Kontrolle Platte. Bei geringer Transformationseffizienz sollte Kulturbedingungen variiert werden, um sicherzustellen Zellen sind im optimalen Zustand sein. Variablen, die Transformationseffizienz beeinflussen, gehören Umgebungstemperatur im Labor (sollte in der Nähe 20 ° C sein) und Handling-Geschwindigkeit (Procedure aus Pelletierung Zellen [2.3] der Besserung [2.7] sollte ~ 1 Stunde dauern). Es ist auch wichtig, dass alle Lösungen einRe machte vor jeder Transformation frisch. Für die Aufnahme in Platten, ist die Konzentration der LMP-Agarose von entscheidender Bedeutung. Ostreococcus Zellen nicht in hohen Konzentrationen Agarose wachsen, und in geringen Konzentrationen zu diffundieren.
Drei Transformationsvektoren für Ostreococcus wurden bisher 6, veröffentlicht und Vektoren zu erzielenden und veröffentlicht kurz. Die vorhandenen Vektor Pot-Luc 6 ermöglicht die Verwendung eines Promotors der Wahl in Kombination mit einem C-terminalen Glühwürmchen-Luciferase-Tag eine schnellere Auswahl sowie transgene Linie handhabbar Expressionsmuster, während die Potox Vektor 6 trägt die starken induzierbaren Promotor aus der 13 entnommen Ostreococcus hoher Affinität Phosphat Transporter (HAPT)-Gen für die Überexpression des Gens von Interesse. Die Potox-Luc Vektor leitet sich von Potox, das Tragen einer zusätzlichen Marker, der Luciferase für indirekte Wahl der Überexpression Linien verwendet werden können <sbis> 14. Erfolgreiche Selektionsmarker auf diesen Vektoren sind Nourseothricin und G148. Jedoch sind Ostreococcus Zellen gegen viele Antibiotika, und die Konzentrationen von Verbindungen, die für Selektion von transgenen Ostreococcus Zellen höher ist als bei herkömmlichen Modellsystemen (2 mg / ml).
Obwohl das Verfahren als ineffizient, stellt die große Anzahl von Zellen und Plasmid-DNA für dieses Verfahren erforderlich keinen signifikanten Hindernis. Eine größere Einschränkung ist, dass jede Zeile erzeugt, die resistent gegen den Selektionsmarker ist es, individuell analysiert werden muss, um zu überprüfen, dass das gesamte Konstrukt in der DNA integriert wird. Wir haben Beispiele, in denen die erfolgreiche Expression des selektierbaren Markers nicht um das Einsetzen des tatsächlichen Gen von Interesse entsprach, beobachtet, dh teilweise Integrationen auftreten können. Offensichtlich zufällige Insertion in das Genom bedeutet auch, dass es keine Kontrolle der Insertionsstelle mit diesen Verfahren und Methoden, basierend auf homologe Rekombination werden derzeit entwickelt. Aber das hier beschriebene Verfahren ist, nach bestem Wissen, derzeit die einzige Methode, um dadurch genetisch veränderten Zellen Ostreococcus generieren.
Als Ostreococcus tauri hat erst vor kurzem als ein experimentelles Modell Organismus benutzt wurde, ist den meisten Methoden der Arbeit mit diesen Zellen wahrscheinlich entwickeln und durch die wachsende Forschungsgemeinschaft beteiligt verfeinert werden. Dieses Protokoll soll den Menschen helfen, initiieren Arbeit mit Ostreococcus, aber keineswegs behauptet, alles, was man über genomische Transformation dieser Mikroalge kennen zu beschreiben. Die Autoren vertrauen, dass die Leser in der Lage, dieses Protokoll, um ihre eigenen Bedürfnisse als kleine Unterschiede in Inkubatoren (Lichtverhältnisse oder Qualität) und andere Parameter anzupassen und existieren wird wahrscheinlich in jedem einzelnen Labor optimiert werden, um die gesunde Kulturen dazu benötigte erhalten Protokoll. Nach Bewältigung der hier beschriebenen Techniken,Vektoren können zur lumineszierenden, fluoreszierenden oder anderen markierte Fusionsproteine Leitungen unter der Steuerung einer Reihe von Promotoren zu erzeugen. Dieses aufregende neue experimentelle Plattform wird nützlich sein, zu untersuchen, wie komplizierte biochemische Probleme in einem Eukaryonten mit reduzierter Komplexität, in denen pharmakologische Ansätze hoch 3 sind erleichtert, gelöst werden.
The authors have nothing to disclose.
SynthSys ein Zentrum für Integrative Systems Biology von BBSRC und EPSRC Auszeichnung D019621 finanziert. EU FP6 Network of Excellence "Marine Genomics" Zuschuss an FYB hat die Entwicklung der genetischen Transformation Methoden finanziert.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |