Questo articolo descrive la trasformazione genetica della marina alga unicellulare<em> Ostreococcus Tauri</em> Mediante elettroporazione. Questo organismo eucariotico è una piattaforma modello efficace per le piante superiori, possesing notevolmente ridotto la complessità genomica e cellulare ed essere facilmente suscettibili di sia la cultura della biologia cellulare e chimica.
I problemi più comuni che ostacolano rapidi progressi in Scienze della pianta includono cellulare, tissutale e la complessità intero organismo, e in particolare l'alto livello di ridondanza genomica genetica che colpisce semplici piante superiori. Il nuovo modello di organismo Ostreococcus Tauri è il più piccolo a vita libera eucariote conosciuta fino ad oggi, e possiede una dimensione del genoma molto ridotto e 1,2 la complessità cellulare, si manifesta con la presenza di solo uno dei molti organelli (mitocondri, cloroplasti, pila del Golgi) per cella, e un genoma contenente soltanto ~ 8000 geni. Inoltre, la combinazione di unicellulari e della cultura semplice fornisce una piattaforma suscettibile di approcci di biologia chimica. Recentemente, Ostreococcus è stato impiegato con successo per studiare i meccanismi fondamentali alla base di indicazione dell'ora circadiano 3-6. I risultati di questo organismo modello hanno avuto un impatto non solo la scienza delle piante, ma anche la biologia dei mammiferi 7. Questo esempio mette in luce come una rapida sperimentazione in uneucariote semplice dal lignaggio verde può accelerare la ricerca in organismi più complessi, generando ipotesi verificabili con metodi tecnicamente fattibile solo in questo contesto di complessità ridotta. La conoscenza del genoma e la possibilità di modificare i geni sono strumenti essenziali nelle varie specie di modello. Genomic 1, 8 trascrittomica, proteomica e 9 le informazioni per questa specie è liberamente disponibile, mentre i metodi precedentemente segnalati 6,10 per trasformare geneticamente Ostreococcus sono noti a pochi laboratori in tutto il mondo.
In questo articolo, i metodi sperimentali per trasformare geneticamente questo nuovo organismo modello con una sovraespressione costruire mediante elettroporazione è descritta in dettaglio, come pure il metodo di inserimento di cellule trasformate in percentuale agarosio bassa per consentire la selezione delle linee trasformate proveniente da un singola cellula trasformata. Dopo il successo dell'applicazione OstreocoCCU alla ricerca circadiano, l'interesse crescente Ostreococcus si può aspettare da aree di ricerca diverse all'interno e all'esterno delle scienze vegetali, comprese le zone biotecnologiche. I ricercatori provenienti da una vasta gamma di scienze biologiche e mediche che lavorano su conservate vie biochimiche può prendere in considerazione la ricerca perseguendo in Ostreococcus, senza la complessità genomica e organismal di specie modello più grande.
Cellular axeny stato e la cultura è di cruciale importanza per la procedura di trasformazione. Sebbene le celle sono generalmente mantenute in cicli di 12 ore di luce, 12 ore buio, l'efficienza della trasformazione in cellule coltivate in queste condizioni sono risultate insufficienti. Durante i ripetuti pellettatura / risospensione passi, le celle devono sempre risospendere facilmente. Se aggregato cellule, o una sostanza simile a muco è presente, è meglio per iniziare la procedura dall'inizio di nuovo. Tipicamente, ~ 50 colonie può essere previsto su ciascuna piastra di trasformazione, rispetto nessuno sulla piastra di controllo negativo. In caso di scarsa efficienza di trasformazione, condizioni di coltura deve essere variato per garantire cellule sono nello stato ottimale. Le variabili che influenzano l'efficienza della trasformazione includono la temperatura ambiente in laboratorio (dovrebbe essere prossima ai 20 ° C) e velocità di movimentazione (Procedura di pellet cellule [2,3] per il recupero [2.7] dovrebbe prendere ~ 1 ora). È altresì importante che tutte le soluzioni are preparato fresco prima di ogni trasformazione. Per l'inclusione in piastre, la concentrazione di agarosio LMP è cruciale. Cellule Ostreococcus non crescerà in concentrazioni elevate di agarosio, e si diffonderà in basse concentrazioni.
Tre vettori di trasformazione per Ostreococcus sono stati pubblicati in precedenza 6, e più vettori dovrebbero essere generato e pubblicato a breve. Il vettore esistente Pot-Luc 6 permette l'utilizzo di un promotore di scelta in combinazione con un C-terminale tag lucciola, luciferasi permettendo la selezione della linea più veloce, più modelli di espressione transgenica trattabili, mentre il vettore Potox 6 porta la forte promotore inducibile 13 ricavati dal Ostreococcus alta affinità fosfato Transporter (HAPT) gene per la sovraespressione del gene di interesse. Il Potox-Luc vettore deriva da Potox, portando un marcatore addizionale luciferasi che può essere utilizzato per la selezione indiretta di linee sovraespressione <sup> 14. Marcatori di selezione di successo su questi vettori sono Nourseothricin e G148. Tuttavia, le cellule Ostreococcus sono altamente resistenti a molti antibiotici, e le concentrazioni dei composti necessari per la selezione di cellule transgeniche Ostreococcus è più elevato che per sistemi modello convenzionale (2 mg / ml).
Sebbene il processo risulta inefficiente, il numero di cellule e il DNA plasmide necessari per questa procedura non pone alcun ostacolo significativo. Una limitazione è più grande che ogni riga generato che è resistente al marcatore selezionabile deve essere analizzato singolarmente per verificare che l'intero costrutto viene integrato nel DNA. Abbiamo osservato esempi in cui espressione riuscita del marcatore selezionabile non corrispondono all'inserimento del gene di interesse effettivo; integrazioni cioè parziali possono verificarsi. Evidentemente, inserimento casuale nel genoma significa anche che non vi è alcun controllo del sito di inserimento utilizzando questo metodo, e metodi bulla base ricombinazione omologa sono attualmente in fase di sviluppo. Tuttavia, il metodo qui descritto è, a nostra conoscenza, attualmente l'unico metodo caratterizzato per generare cellule Ostreococcus geneticamente modificate.
Come Ostreococcus tauri solo recentemente è stata utilizzata come organismo modello sperimentale, la maggior parte dei metodi di lavoro con queste cellule è probabile evolversi ed essere perfezionato dalla comunità di ricerca sempre più coinvolta. Questo protocollo ha lo scopo di aiutare le persone con Ostreococcus avviare i lavori, ma in nessun modo pretende di descrivere tutto quello che c'è da sapere su genomica trasformazione di questa microalga. La fiducia gli autori che i lettori saranno in grado di adattare questo protocollo per le proprie esigenze, come piccole differenze di incubatori (livelli di luce o la qualità) e di altri parametri esistono e probabilmente devono essere ottimizzati in ogni singolo laboratorio per ottenere le culture sane necessari per questo protocollo. Dopo aver imparato le tecniche descritte qui,vettori possono essere costruiti per generare luminescente, fluorescenti, o altre linee di fusione etichetta sotto il controllo di una serie di promotori. Questo entusiasmante piattaforma sperimentale romanzo sarà utile per studiare come biochimici complessi problemi sono risolti in un eucariote di complessità ridotta, in cui approcci farmacologici sono molto facilitati 3.
The authors have nothing to disclose.
SynthSys un Centro per Integrative Systems Biology e finanziato dalla BBSRC premio D019621 EPSRC. EU FP6 Network of Excellence borsa di studio "Marine Genomics" per Fyb ha finanziato lo sviluppo di metodi di trasformazione genetica.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |