Denne protokol beskriver regelmæssig vedligeholdelse og pleje for at opretholde optimale betingelser for zebrafisk dyrehold. Videoen illustrerer den protokol, for systemvedligeholdelse, regelmæssig boliger, fodring, avl, samt optagelse af zebrafisk larver.
Denne protokol beskriver regelmæssig pleje og vedligeholdelse af en zebrafisk laboratorium. Zebrafisk er nu stigende popularitet i genetik, farmakologiske og adfærdsmæssige forskning. Som et hvirveldyr, er zebrafisk aksjer betydelig genetisk sekvenslighed med mennesker og anvendes som en dyremodel for forskellige humane sygdomstilstande. Fordelene ved zebrafisk i forhold til andre almindelige hvirveldyr modeller omfatter høj frugtbarhed, lave vedligeholdelsesomkostninger, gennemsigtige embryoner, og hurtig udvikling. På grund af den spur af interesse i zebrafisk forskning, behovet for at etablere og opretholde en produktiv zebrafisk hus facilitet er også stigende. Selv om litteraturen er tilgængelig for opretholdelsen af et zebrafisk laboratorium, er en kortfattet videoprotokollatet mangler. Denne video illustrerer den protokol for regelmæssig boliger, fodring, avl og opdræt af zebrafisk larver. Denne proces vil hjælpe forskerne til at forstå den naturlige adfærd og optimale betingelser for zebrafish dyrehold og dermed fejlfinding eksperimentelle problemer, der stammer fra fisk opdrætsbetingelser. Denne protokol vil være af enorm hjælp til forskere, der planlægger at etablere en zebrafisk laboratorium, og også for studerende, der ønsker at bruge zebrafisk som en dyremodel.
Zebrafisk stammer fra Ganges-floden i det nordlige Indien og er ved at blive populære i forskning i både deres voksne og larvestadier 2, revideret af Spence et al. 3. Zebrafisk har flere fordele i forhold til andre dyremodeller såsom høj frugtbarhed, nem vedligeholdelse, optisk clearance af embryoner, hurtig embryonale udvikling, og lave vedligeholdelsesomkostninger. De er modtagelige for genetisk manipulation 6 og egnet til high-throughput lægemiddel-screening 4,5. Befrugtningen er ekstern hvilket er fordelagtigt for deres anvendelse ved udviklingsmæssige biologer. På grund af disse fordelagtige egenskaber, er zebrafisk stigende popularitet i genetik 7, farmakologiske 8, og adfærdsforskning 9,10. Der er en række udfordringer for at opretholde en zebrafisk facilitet og zebrafisk dyrehold at få embryoner. Heri beskriver vi vores erfaringer og anbefalinger til at håndtere disse udfordringer og outline en protokol for systemvedligeholdelse, fodring, avl og hævning af larverne.
Systemvedligeholdelse
For at opretholde zebrafisk i en sund tilstand, er det vigtigt at give dem et rent miljø i et velfungerende akvarium system. En vigtig del af dette er ved at ændre systemet filtre regelmæssigt, således at alle tankene får ordentlig vandflow og rent vand. Det er afgørende at undgå svigt i cykling vandforsyningen til hver tank på grund af blokerede systemet rør. Rørene kan rengøres med en højere end normal vand tryk og flow, hvis blokering forekommer. Ideelt set bør omkring 10% af systemets vand udskiftes dagligt for at opretholde en god vandkvalitet. Alternativt kan vand udskiftes, mens Udskiftning af beholder eller Carbon filter. Dette sikrer, at snavs aflejret i rørene forbinder disse filtre, fjernes. Kvaliteten af vand bør kontrolleres regelmæssigt. Parametre som alkalinitet, pH, temperature, hårdhed, ammoniak, opløst ilt, saltholdighed, og ledningsevne bør betragtes som vigtige faktorer i repræsenterer kvaliteten af vandet i systemet (se tabel 2 for detaljer). I det mindste nitrat, pH og temperatur overvåges regelmæssigt for at sikre god vandkvalitet for boliger zebrafisk. Ideal nitrat (NO3 -) niveauer er <50 mg / L 11, hvis høj disse niveauer kan reduceres ved at erstatte vandet i cirkulationssystem med det friske systemet vand. Lejlighedsvis, behøver filtrene ikke passer godt og lække, så det anbefales at tjekke for lækager efter et filter skift. Hvis vandstrømmen fra hovedreservoiret blokeres enten efter ændring af vandpumpen eller ændrer et filter, kan flowet genoprettet ved enten at løsne eller fjerne filteret i et par sekunder for at frigive noget vakuum genereres i rørene. Den nødvendige tid til at skifte filtrene kan variere afhængigt af forskellige faktorer såsom den samlede biologiske belastning on systemet, renholdelse af andre filtre, og snavs aflejret i rørene. Derfor bør filtre straks udskiftes, hvis de forekommer snavset eller hvis alle tankene ikke får den rette vandforsyning. Det anbefales også, at fiskenet renses med 70% ethanol og skyllet i vand for at rense den og tillades at tørre, før det genanvendes. Tørring sikrer fordampning af ethanol, som ellers er giftigt for fisk.
De fleste af zebrafisk systemer anvender de-chloreret ledningsvand, men nogle systemer anvender deioniseret vand. Det er vigtigt at holde ledningsevnen af vandet i systemet mellem 300 og ~ 1.500 mikrosiemens, da dette reducerer den energi fisken nødt til at opretholde kroppens salte. Derfor kan zebrafisk ikke opbevares i demineraliseret vand, hvis salte tilsættes for at opretholde de optimale ledningsevne niveauer. Der er risiko af mulige høje kobberkoncentrationer i systemet vand, hvis ledningsvand anvendes, fordi kulfilter ikke fjerner kobber. Derfor uSERS skal tjekke for kobberkoncentrationer og undgå kobberrør hvor det er muligt.
Fodring
Zebrafisk bør aldrig bøvet, da dette kan øge nitratindholdet i vandet, hvilket muligvis påvirker deres opdræt 11, eller levedygtighed, da nogle fisk kan dø på grund af overspisning. Vi anbefaler, giver ikke mere mad i løbet af et fodring end en tank af fisk kan afslutte indenfor 10 min. Det er meget vigtigt at fjerne salt fra saltlagen rejer, inden de indføres i zebrafisk som overskydende saltkoncentration forårsager dødsfald. Hvis flere zebrafisk æg er påkrævet, kan fiskene fodres tre gange om dagen. Rengøring opdrætteren akvarier dagligt forbedrer også niveauet af ægproduktionen.
Ved fodring på de akvatiske naturtyper systemer, vi normalt slukke for vandpumpe og luft pumpe til at tillade fisk at spise den mad i 10 min. Dette reducerer mængden af mad, der er skyllet ind filtrene. Dog skal brugerne være omhyggelig med at remGlød at tænde disse pumper igen bagefter.
Avl
Zebrafisk er normalt på optimal avl tilstand mellem ~ 3 og 18 måneder. Parvis avl bør ikke udføres i to efterfølgende dage 11, men kan i-tank avl udføres dagligt som en tank kan rumme mange fisk, der reducerer chancen for det samme par af fisk opdrættes i to dage i træk. Avl bør foretages med jævne mellemrum, selvom æg er ikke påkrævet. Denne fremgangsmåde vil sikre avlscyklus af fisken opretholdes. Det anbefales, at der er flere kvinder end mænd, der gennem opdræt set-up. Mand zebrafisk ændre deres kvindelige partnere på daglig basis 12, som yderligere støtter denne anbefaling. Desuden inden for vores laboratorium vi oprindeligt havde problemer med avl, men ved hjælp af flere kvinder end mænd i et avlsprogram set-up hjalp med at løse problemet. Desuden fodring med et højt proteinindhold content kost og artemia 2-3 gange om dagen, blanding fisk fra forskellige tanke (fra forskellige forældre), idet temperaturen af opdrætningsbassinet set-up mellem 27 og 28 ° C, og presse maver hunner med blokerede ovarieceller rør med blid massage yderligere forbedret ægproduktion. Vi anbefaler at holde et referat af fisk linjer / oprindelse for at undgå in-avl mellem søskende. Dette forbedrer yderligere embryo produktion. Holde en opgørelse over antallet af embryoner lagt af fisk fra hver tank er også anbefales. Dette hjælper med at holde et spor af de bedste avlsdyr fisk tanke og træffe foranstaltninger til at forbedre avlen i fiskene ikke lægge æg.
Hævning af larver
Fodring af larver skulle begynde fra 5 dpf (dage efter befrugtningen). Unge larver kan fodres med tørfoder på ~ 100 mikrometer i størrelse (f.eks ZM100) eller levende foder såsom Paramecium og hjuldyr (som stimulerer vækst). Fødevarer størrelse kan langsomt øgestil 200 mikrometer (f.eks ZM200) eller 300/400 micron (f.eks ZM300). En population af voksne fisk bør være omkring 6-7 fisk per liter vand. Denne praksis anbefales til bedre vedligeholdelse af BOD (biologisk iltforbrug) til tankene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Tammy Esmaili for hendes hjælp i forvaltningen af laboratorie forbrugsstoffer. AA er modtageren af et ph.d.-stipendium fra Center of Excellence for Alzheimers Disease Research og pleje, School of Medical Sciences, Edith Cowan University. MC modtager ph.d.-støtte fra Rotary Club, Perth. AM, er GV, KT, og RNM finansieret af McCusker Alzheimers Research Foundation.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | |
Zebrafish circulating system | Aquatic Habitats, USA | AHAB stand-alone, bench-top systems | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | |
Fish food dispenser/Dry food feeder | Aquatic Habitats, USA | AH19 | |
Microscope | Olympus | SZX12 | |
Dry Food | ZM Fish food, UK | ZM100, ZM200, ZM300 | |
Brine shrimp eggs | Salt Creek, Inc., USA | Premium Grade | |
In-tank breeders | Aquatic Habitats, USA | ITSTS-A | |
Activated carbon | Penn-Plax Pro-crab, USA | PBC3MF | |
Breeding tanks | Aquatic Habitats, USA | SBTANK (1L) Breeder Tank-2 (2L) |
|
Red sea salt | Red sea salt, USA | Local pet store/ www.redseafish.com |
|
Filters (Canister, filter pads, and UV) | Aquatic Habitats, USA | aquatichabitats.com | |
Siporax Media | Aquatic Habitats, USA | BF 820 | |
Brine shrimp net | Aquatic Habitats, USA | BSN 1 | |
Brine shrimp hatcher | Aquatic Habitats, USA | BS252 | |
Baffles | Aquatic Habitats, USA | aquatichabitats.com | |
Table 1. Table of specific reagents and equipment used in this protocol. |