Detta protokoll beskriver regelbundet underhåll och skötsel för att upprätthålla optimala förhållanden för zebrafisk djurhållning. Videon visar protokollet för systemunderhåll, ordinärt boende, utfodring, avel och uppfödning av zebrafisk larver.
Detta protokoll beskriver regelbunden vård och underhåll av en zebrafisk laboratorium. Zebrafisk nu ökar i popularitet i genetik, farmakologisk och beteendevetenskaplig forskning. Som ett ryggradsdjur, är zebrafisk delar avsevärd genetisk sekvens likhet med människor och används som en djurmodell för olika humana sjukdomstillstånd. Fördelarna med zebrafisk i jämförelse med andra vanliga ryggradsdjur modeller inkluderar hög fruktsamhet, låg underhållskostnad, transparenta embryon och snabb utveckling. På grund av sporre intresset zebrafisk forskning, behovet av att skapa och upprätthålla en produktiv anläggning zebrafisk bostäder ökar också. Även litteratur finns tillgänglig för att upprätthålla en zebrafisk laboratorium, är en kortfattad video protokoll saknas. Denna video visar protokollet för ordinärt boende, utfodring, avel och uppfödning av zebrafisk larver. Denna process kommer att hjälpa forskarna att förstå naturliga beteende och optimala zebrafish djurhållning och därmed felsöka experimentella frågor som kommer från de villkor fisk djurhållning. Detta protokoll kommer att vara till enorm hjälp för forskare som planerar att etablera en zebrafisk laboratorium, samt att doktorander som har för avsikt att använda zebrafisk som en djurmodell.
Zebrafisk kommer från floden Ganges i norra Indien och blir populär i forskning både deras vuxna och larvstadier 2, granskas av Spence et al. 3. Zebrafisk har flera fördelar jämfört med andra djurmodeller såsom hög fruktsamhet, enkelt underhåll, optisk clearance av embryon, snabb embryonal utveckling och låga underhållskostnader. De är mottagliga för genetisk manipulation 6 och lämplig för hög genomströmning drog screening 4,5. Deras befruktning är extern vilket är fördelaktigt för deras användning av utvecklings biologer. På grund av dessa fördelaktiga egenskaper är zebrafisk ökar i popularitet i genetik 7, farmakologiska 8 och beteendevetenskaplig forskning 9,10. Det finns ett antal utmaningar för att upprätthålla en zebrafisk anläggning och zebrafisk djurhållning för att få embryon. Häri beskriver vi våra erfarenheter och rekommendationer för att lösa dessa utmaningar och outline ett protokoll för systemunderhåll, utfodring, avel och höjning av larverna.
Systemunderhåll
För att upprätthålla zebrafisk i en hälsosam kondition, är det viktigt att förse dem med en ren miljö i ett väl fungerande akvarium systemet. En viktig del av detta håller på att förändras systemet filter regelbundet så att alla tankar får ordentlig vattenflöde och rent vatten. Det är viktigt att undvika fel i cykling vattenförsörjningen till varje tank på grund av blockerade systemet rör. Rören kan rengöras med en högre än normalt vattentryck och flöde om blockering sker. Helst bör cirka 10% av systemets vattnet bytas dagligen för att upprätthålla en god vattenkvalitet. Alternativt, kan vatten bytas samtidigt ändrar kapsel eller Kolfilter. Detta säkerställer att smuts deponeras i rören som förbinder dessa filter avlägsnas. Kvaliteten på vattnet bör kontrolleras regelbundet. Parametrar såsom alkalinitet, pH, temperaure, hårdhet, ammoniak, löst syre, salthalt, och konduktivitet bör betraktas som viktiga faktorer i representerar systemets kvalitet vatten (se tabell 2 för detaljer). Åtminstone nitrat bör pH och temperatur övervakas regelbundet för att säkerställa god vattenkvalitet för bostäder zebrafisk. Idealiskt nitrat (NO 3 -) nivåer <50 mg / L 11, om hög dessa nivåer kan reduceras genom att ersätta vattnet i cirkulerande systemet med färskt systemvattnet. Ibland passar filter inte bra och läcker så det rekommenderas att leta efter läckor efter en filterbyte. Om vattenflödet från den huvudsakliga reservoaren blockeras antingen efter byte av vattenpumpen eller ändra ett filter, kan vattenflödet återställas antingen genom att lossa eller ta bort filtret för några sekunder för att släppa någon vakuum genereras i rören. Den tid som krävs för att byta filter kan variera beroende på olika faktorer såsom total biologisk belastning on systemet, renlighet andra filter, och smuts deponeras i rören. Därför bör filter omedelbart bytas om de verkar smutsiga eller om alla tankar inte får rätt vattenförsörjning. Det rekommenderas också att fisken nätet rengöras med 70% etanol, och sköljas i vatten för att sanera den och får torka innan den återanvänds. Torkning säkerställer avdunstning av etanol som annars är giftigt för fisk.
De flesta av de zebrafisk systemen använder de-klorerat kranvatten, men vissa system använder avjoniserat vatten. Det är viktigt att hålla konduktivitet systemvattnet mellan 300 och ~ 1.500 iS eftersom detta minskar den energi fisken måste upprätthålla kroppssalter. Därför kan zebrafisk inte hållas i avjoniserat vatten inte salter tillsätts för att upprätthålla de optimala ledningsförmåga nivåerna. Det finns en risk för eventuella höga kopparkoncentrationer i systemet vatten om kranvatten används eftersom kolfiltret inte avlägsnar koppar. Därför, uSERS borde kontrollera kopparkoncentrationer och undvika kopparrör där det är möjligt.
Utfodring
Zebrafisk ska aldrig övergödd, eftersom detta kan öka nitrathalten i vattnet, eventuellt påverkar deras avel 11 eller livskraft, som vissa fiskar kan dö på grund av överätande. Vi rekommenderar att tillhandahålla inte mer mat under någon matning än en tank av fisk kan avsluta inom 10 minuter. Det är mycket viktigt att ta bort saltet från Artemia innan utfodra dem till zebrafisk som överskottet saltkoncentration orsakar död. Om fler zebrafisk ägg krävs kan fiska matas tre gånger om dagen. Rengöring av tankar uppfödare fisk dagligen förbättrar också nivåerna av äggproduktion.
Vid matning på akvatiska livsmiljöer system vi slår oftast av vattenpumpen och luftpump så att fisken att äta mat i 10 min. Detta minskar den mängd mat som tvättas i filtren. Måste dock användaren vara noga med att remglödkol att slå på dessa pumpar igen efteråt.
Avel
Zebrafisk är oftast vid optimal avel tillstånd mellan ~ 3 och 18 månaders ålder. Parvis avel bör inte utföras under två på varandra följande dagar 11, men kan i-tank avel utförs dagligen som en tank kan hålla många fiskar vilket minskar risken för att samma par av fisk som föds upp för två dagar i rad. Avel bör ske med jämna mellanrum även om äggen inte behövs. Denna process kommer att säkerställa avel cykel av fisken bibehålls. Det rekommenderas att det finns fler kvinnor än män i en avel set-up. Man zebrafisk ändra sina kvinnliga partners på daglig basis 12 som ytterligare stöder denna rekommendation. Dessutom, i vårt laboratorium upplevde vi först problem med avel, men med fler honor än hanar i avel installation hjälpte att lösa problemet. Dessutom utfodring med hög proteinhalt content kost och artemia 2-3 gånger om dagen, blandning fisk från olika tankar (från olika föräldrar), varvid temperaturen på avel installation mellan 27 och 28 ° C, och klämma magar av kvinnor med blockerade äggstock rör med mild massage förbättrats ytterligare äggproduktion. Vi rekommenderar föra register över fisk linjer / ursprung för att undvika in-avel mellan syskon. Detta förbättrar ytterligare embryo produktion. Föra register över antalet embryon som av fisk från varje tank rekommenderas också. Detta hjälper till att hålla ett spår av de bästa tankar odling av fisk och vidta åtgärder för att förbättra uppfödning i fisken inte lägga ägg.
Uppfödning av larver
Utfodring av larver bör påbörjas från 5 dpf (dagar efter befruktning). Unga larver kan matas med torrfoder av ~ 100 mikron (t.ex. ZM100) eller levande mat som Paramecium och hjuldjur (som stimulerar tillväxt). Livsmedel storlek kan sakta ökastill 200 mikron (t.ex. ZM200) eller 300/400 mikron (t.ex. ZM300). En population av vuxna fiskar bör vara cirka 6-7 fiskar per liter vatten. Denna praxis rekommenderas för bättre underhåll av BOD (Biological Oxygen Demand) till tankarna.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Tammy Esmaili för hennes hjälp i förvaltningen av laboratorie förbrukningsvaror. AA är mottagare av en doktorsexamen Stipendium från spetsenheten för Alzheimers sjukdom forskning och vård, skola för medicinska vetenskaper, Edith Cowan University. MC får PhD finansiellt stöd från Rotary, Perth. AM är GV, KT, och RNM finansieras av McCusker Alzheimers Research Foundation.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | |
Zebrafish circulating system | Aquatic Habitats, USA | AHAB stand-alone, bench-top systems | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | |
Fish food dispenser/Dry food feeder | Aquatic Habitats, USA | AH19 | |
Microscope | Olympus | SZX12 | |
Dry Food | ZM Fish food, UK | ZM100, ZM200, ZM300 | |
Brine shrimp eggs | Salt Creek, Inc., USA | Premium Grade | |
In-tank breeders | Aquatic Habitats, USA | ITSTS-A | |
Activated carbon | Penn-Plax Pro-crab, USA | PBC3MF | |
Breeding tanks | Aquatic Habitats, USA | SBTANK (1L) Breeder Tank-2 (2L) |
|
Red sea salt | Red sea salt, USA | Local pet store/ www.redseafish.com |
|
Filters (Canister, filter pads, and UV) | Aquatic Habitats, USA | aquatichabitats.com | |
Siporax Media | Aquatic Habitats, USA | BF 820 | |
Brine shrimp net | Aquatic Habitats, USA | BSN 1 | |
Brine shrimp hatcher | Aquatic Habitats, USA | BS252 | |
Baffles | Aquatic Habitats, USA | aquatichabitats.com | |
Table 1. Table of specific reagents and equipment used in this protocol. |